豬α干擾素體外抗PRRSV活性研究及河南省PRRSV毒株遺傳變異分析.pdf

1、豬α干擾素具有顯著的抗病毒作用，真核表達(dá)的豬α干擾素生物學(xué)活性較高，因此研究真核表達(dá)的豬α干擾素對治療PRRSV具有重要意義。本研究利用實(shí)驗(yàn)室保存的豬α干擾素真核表達(dá)載體pcDNA3.0-poIFNα轉(zhuǎn)染PK15細(xì)胞，制備干擾素，通過細(xì)胞水平抗病毒試驗(yàn)檢測豬α干擾素體外抗PRRSV活性。PRRSV屬于RNA病毒，其基因組容易發(fā)生變異，變異分布于整個(gè)基因組，其中以GP5基因的變異最大，因此對GP5基因變異的分析在一定程度上可以反映病毒基因

2、組變異的情況。本研究對93株P(guān)RRSV分離株GP5基因進(jìn)行遺傳變異和進(jìn)化，探尋PRRSV流行株進(jìn)化規(guī)律。
　　 本試驗(yàn)利用實(shí)驗(yàn)室保存的豬α干擾素真核表達(dá)載體pcDNA3.0-poIFNα轉(zhuǎn)染PK15細(xì)胞，用G418進(jìn)行篩選并獲得穩(wěn)定表達(dá)豬α干擾素的PK15細(xì)胞系，收集轉(zhuǎn)染后的PK-15細(xì)胞，提取PoIFNα的mRNA，用PCR方法檢測到干擾素基因的表達(dá)，并用ELISA試劑盒檢測豬α干擾素蛋白的表達(dá)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，測得真核表達(dá)的豬

3、α干擾素濃度為910.56pg/ml。
　　 本試驗(yàn)通過在PRRSV分別感染外周血單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞前，用不同濃度干擾素處理細(xì)胞，利用實(shí)驗(yàn)室建立的PRRSV熒光定量PCR方法，檢測PRRSV在感染后24h、48h、72h的病毒mRNA水平。結(jié)果顯示，2到32倍稀釋干擾素(28.46-455.28pg/ml)能在感染24-48h抑制病毒在外周血單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞增殖，但72h后，外周血單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞上病毒mRNA水平較病毒感染

4、組升高。其中16倍稀釋干擾素(56.91pg/ml)預(yù)處理的外周血單核細(xì)胞，在病毒感染后24h，病毒mRNA拷貝數(shù)與對照組相比差異最顯著，降低8.8倍；感染后48h，用2、16、64倍稀釋干擾素(濃度分別為455.28pg/ml、56.91pg/ml、14.23pg/ml)預(yù)處理組，病毒mRNA水平與對照組相比分別降低4.7倍、3.4倍、4.8倍，差異顯著。用16倍稀釋干擾素預(yù)處理的巨噬細(xì)胞在感染后24h和48h，病毒mRNA水平最低，

5、分別降低4.64倍、11.01倍，與對照組相比差異最顯著。結(jié)果表明，16倍稀釋的干擾素(56.91pg/ml)抗PRRSV活性最好，干擾素抗病毒活性與病毒感染時(shí)間和干擾素的劑量有關(guān)，干擾素對PRRSV在外周血單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的增殖呈現(xiàn)相似的影響規(guī)律。
　　 根據(jù)2004至2011年60個(gè)河南省PRRSV毒株及33個(gè)其他省份和地區(qū)分離的毒株，分析PRRSV河南分離株的遺傳變異情況。序列比對顯示，河南PRRSV毒株ORF5序列同源

6、性為87.7％-100％。系統(tǒng)發(fā)生分析顯示，60個(gè)河南PRRSV毒株均屬于北美洲型毒株，分屬于3個(gè)基因亞群，其中，亞群Ⅰ毒株占5％(3/60)，亞群Ⅱ毒株占1.7％(1/60)，亞群Ⅲ毒株占93.3％(56/60)?；蛑亟M分析顯示，亞群Ⅰ中毒株JX0601和亞群Ⅲ中毒株HuB0801基因發(fā)生重組，產(chǎn)生亞群Ⅰ中毒株ZJJ07，河南PRRSV毒株在ORF5區(qū)域未檢測到重組事件發(fā)生。選擇壓力分析顯示，河南省PRRSV毒株主要在信號肽區(qū)域、胞

7、外區(qū)1和N端存在陽性選擇，氨基酸變異性較大。密碼子偏性分析顯示，PRRSVORF5基因偏好性使用AGA(R)、ACC(T)、AGC(S)、AUU(I)、UUG(L)、AAC(N)、UCC(S)、CCU(P)、GGU(G)、GUC(V)、CCC(P)、UAU(Y)、GUG(V)密碼子。這些結(jié)果表明，PRRSV在增強(qiáng)病毒感染性、減弱抗體識別及削弱機(jī)體免疫應(yīng)答的關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)存在變異，且多存在陽性選擇。疫苗毒和野毒株可能發(fā)生基因重組。病毒進(jìn)化