胡蘿卜軟腐果膠桿菌與黃花馬蹄蓮不同方式互作的蛋白比較分析及相應致病基因的研究.pdf

1、彩色馬蹄蓮（Zantedeschia sp.）為天南星科多年生球根花卉，因其艷麗的色彩，高雅的姿態(tài)被予為21世紀的“花卉之星”。然而，在全球范圍內(nèi)，由于細菌性軟腐病嚴重發(fā)生，且沒有理想的防治方法，極大的阻礙了彩色馬蹄蓮產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。據(jù)報道，引起彩色馬蹄蓮軟腐病發(fā)病嚴重的病原菌主要是胡蘿卜軟腐果膠桿菌胡蘿卜亞種(Pectobacterium carotovorum subsp.carotovorum，Pcc)。 Pcc通過產(chǎn)生各種植物細胞降

2、解酶(PCWDEs)，如果膠酶、纖維素酶、蛋白酶等致病因子，破壞寄主植物的防御系統(tǒng)并發(fā)生致病癥狀。Pcc能引起多種植物發(fā)生軟腐病，給全世界的農(nóng)業(yè)帶來嚴重的經(jīng)濟損失。
　　 為了探索Pcc在與植物互作過程中的體內(nèi)蛋白質(zhì)差異及這些差異蛋白在致病過程中的作用。本研究以2YT培養(yǎng)基培養(yǎng)的Pcc、與黃花馬蹄蓮離體互作的Pcc、與黃花馬蹄蓮活體互作的Pcc為研究對象，并運用雙向電泳技術(shù)、質(zhì)譜技術(shù)及ImageMaster2D platinum

3、5.0軟件對這三種條件下的Pcc差異表達蛋白質(zhì)進行比較分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn):(1)2YT培養(yǎng)基培養(yǎng)的Pcc和與黃花馬蹄蓮離體互作的Pcc有70個蛋白點存在表達差異，占總蛋白數(shù)的18.12％。其中，利用質(zhì)譜分析對5個表達差異較大的蛋白進行分析發(fā)現(xiàn):2個特異表達蛋白分子伴侶DnaK和1-脫氧木酮糖-5-磷酸合酶(DXS)均為代謝類蛋白;3個顯著上調(diào)表達蛋白中ATP合酶α亞基和半胱氨酸合酶為代謝類蛋白，而β-內(nèi)酰胺酶為抗生素類蛋白，是Pcc的主要致

4、病因子之一。(2)將活體互作的Pcc體內(nèi)蛋白與2YT培養(yǎng)基培養(yǎng)的Pcc和離體互作的Pcc的體內(nèi)蛋白分別進行比較，發(fā)現(xiàn)這三種方式誘導的體內(nèi)差異蛋白中，離體互作和活體互作中蛋白表達存在的差異最大，上調(diào)表達蛋白點68個，上調(diào)率達17.09％，下調(diào)表達蛋白65個，下調(diào)率達16.33％。其中有53個差異蛋白利用質(zhì)譜分析進行功能注釋。
　　 為了驗證這些差異蛋白在Pcc致病過程中的作用，本試驗利用兩親交換方法對表達差異較大的蛋白點進行基因單

5、交換突變，成功構(gòu)建出17個單交換突變體，其中9個突變體沒有致病力差異，8個突變體致病力降低或完全喪失，為△PrmA、△IclR、△ClpP、△FlgK、△PotA、△MreB、△HsP33和△Oadh2A1。
　　 為了進一步驗證闡明鞭毛鉤基因flgKpcc對Pcc的致病性等方面的影響。本研究用兩親同源交換法成功構(gòu)建了基因缺失突變體△flgKpcc，與野生型菌株P(guān)ccS1相比，△flgKpcc鞭毛缺失，菌體易沉降，在0.3％半固