胡蘿卜軟腐果膠桿菌致病相關基因的篩選及功能分析.pdf

1、胡蘿卜軟腐果膠桿菌（Pectobacteriumcarotovorumsubsp.carotovorum，Pcc）是一種重要的植物病原茵，能夠在彩色馬蹄蓮等寄主上引起嚴重的細菌性軟腐病。細胞壁降解酶，如果膠裂解酶、纖維素酶和蛋白酶等，被認為是Pcc的主要致病因子。Pcc引起的軟腐病已經(jīng)給全世界農(nóng)業(yè)帶來嚴重的經(jīng)濟損失，因此對病原茵致病機制的研究已顯得越來越重要。
　　本實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)6-磷酸葡萄糖脫氫酶（glucose-6-ph

2、osphate1-dehydrogenase，Zwf,PC1_1832）和天冬氨酸裂解酶(aspartateammonia-lyase，AspA，PC1_0506)在PccS1與黃花馬蹄蓮（Zantedeschiaelliotiana）互作時上調(diào)表達。本研究通過研究zwf和aspA基因的單交換突變體和雙交換突變體的致病性，發(fā)現(xiàn)與PccS1相比，zwf和aspA基因的單交換突變株致病力顯著降低，而雙交換突變株致病力與野生型基本一致。

3、>　　通過對PccS1菌株全基因組序列進行分析，發(fā)現(xiàn)zwf基因的同向下游基因為2-酮-3-脫氧-6磷酸葡萄糖酸醛縮酶基因（2-keto-3-deoxy-6-phosphogluconatealdolasegene，eda，PC1_1833），并且Eda是ED代謝途徑的兩個關鍵酶之一。本研究采用同源重組法成功構建缺失突變菌株△eda和互補菌株△eda（eda），突變體的表型分析結(jié)果表明，當乙酸鈉作為唯一碳源時，△eda不能正常生長，而野生

4、型生長良好，△eda在LB和MMX培養(yǎng)基中生長速率與PccS1基本一致;△eda對感病寄主黃花馬蹄蓮和大白菜的致病力顯著降低，病斑面積分別下降80.35％和97.51％;突變體的果膠酶形成能力明顯降低，果膠酶檢測平板的水解圈面積下降59.9％;在轉(zhuǎn)錄水平上，調(diào)控基因kdgR，hexA和rsmA出現(xiàn)上調(diào)表達，果膠酶基因pel和peh的轉(zhuǎn)錄表達水平明顯降低。因此，zwf基因單交換子致病力降低可能是由于影響了eda基因的表達;而eda對kdg

5、R表現(xiàn)負調(diào)控作用，當eda缺失后，kdgR表達上調(diào)，pel、peh等受KdgR負調(diào)控的基因被抑制，△eda致病力下降。
　　同樣利用同源重組基因敲除技術，獲得了aspA基因的下游基因缺失突變菌株△dcuA，△cuM1和△cycZ。本研究測定了突變體的運動性、生物膜的形成、胞外酶活性和致病性等表型，與野生型相比，除過氧化氫耐受性和生物膜均有提高外，其它表型均與PccS1相似。表明dcuA，cutA1和cycZ基因的缺失突變并不影響菌