基于BIPES分析微生物群落的生物信息學(xué)方法的建立.pdf

1、微生物以群落形式廣泛存在，它與眾多研究領(lǐng)域密切相關(guān)。在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，人體共生菌群被稱為人的“第二基因組”(The other genome)，與健康密切相關(guān);在環(huán)境領(lǐng)域，微生物以群落形式發(fā)揮功能，驅(qū)動生命基本元素(C/N/S等)發(fā)生生物地球化學(xué)循環(huán)，分解各種污染物;在生態(tài)學(xué)領(lǐng)域本身，存在更多與微生物群落結(jié)構(gòu)以及其動態(tài)變化相關(guān)的內(nèi)容;此外，與微生物群落相關(guān)的研究領(lǐng)域還包括工業(yè)與資源微生物、農(nóng)業(yè)與土壤微生物等。
　　 欲解答與微生物群落

2、相關(guān)的科學(xué)問題，首先必須清晰準(zhǔn)確地分析微生物群落結(jié)構(gòu)，即樣品中存在的微生物種類，以及各種類的數(shù)量。但是，在傳統(tǒng)的微生物群落分析方法中，“通量”、“準(zhǔn)確性”、以及“成本”三大因素的制約使得微生物群落的測定成為多學(xué)科瓶頸技術(shù)?！案咄俊笔侵福槍蝹€樣品，需獲得高通量的數(shù)據(jù);同時，采用該方法分析樣品的通量要夠高，即能夠同時分析較多數(shù)量的樣品。對微生物群落結(jié)構(gòu)研究方法而言，“準(zhǔn)確”一方面指微生物種屬（或稱分類單元）的表征信息要盡可能明確;另一

3、方面，對不同分類單元的定量要盡可能準(zhǔn)確。但是，傳統(tǒng)技術(shù)如DGGE、基因芯片等手段均不能在較低的成本下，實現(xiàn)高通量和準(zhǔn)確的需求。
　　 近年來，通過454測序技術(shù)測定16S rRNA短標(biāo)簽序列成為微生物群落研究領(lǐng)域的突破。它利用焦磷酸測序法獲得高通量的數(shù)據(jù)及相關(guān)生物信息學(xué)工具的交互發(fā)展促成微生物群落結(jié)構(gòu)研究方法學(xué)的突破。但是，454測定16S rRNA標(biāo)簽技術(shù)因成本較高，阻礙其普及運用，同時測序錯誤及生物信息學(xué)計算工具也還存在一些

4、問題。
　　 與454技術(shù)相比，Illumina平臺能夠提供更多的序列數(shù)量，從而顯著提高樣品分析通量，降低分析成本，并且序列準(zhǔn)確性更高。但是，Illumina的測序特征是序列長度較短，過去不能達(dá)到測定16S rRNA可變區(qū)的需求。同時，由于Illumina平臺所獲得的序列數(shù)量成數(shù)十倍增長，原有的生物信息學(xué)分析工具均不能運用，如何解決其中的運算瓶頸也是制約Illumina分析微生物群落的關(guān)鍵之處。
　　 本論文首先驗證了通

5、過條碼引物擴(kuò)增16S rRNA可變區(qū)，對PCR產(chǎn)物整體進(jìn)行Illumina雙末端測序，進(jìn)而通過序列分揀、拼接、質(zhì)控、比對等生物信息學(xué)分析，獲得目標(biāo)樣品中的微生物群落代表序列的新方法。該方法稱為BarcodedIllumina Paired End Sequencing，簡稱BIPES。本研究中，我們首次通過IlluminaPE75以及PE101測序技術(shù)（隨著測序技術(shù)的進(jìn)展），測通16S rRNA的V6可變區(qū)，并建立一系列質(zhì)控算法，比較不

6、同分析流程的準(zhǔn)確性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Illumina單末端序列的準(zhǔn)確度僅為約97.9％，其分布特征為從序列開始5'端的99.9％到末端3'端的85％。在雙末端序列的反向互補(bǔ)拼接過程中，質(zhì)量下降的3'端序列得到校正，從而將測序準(zhǔn)確度顯著增加到99.65％。進(jìn)而通過去除40-70 bp位點有2個或以上的錯配堿基，和引物區(qū)有錯誤的序列之后，BIPES序列的準(zhǔn)確性進(jìn)一步提高到99.93％。其中錯誤堿基比454法降低了1個數(shù)量級。本論文發(fā)現(xiàn)，BIPES

7、序列能夠基本反映初始模板中各序列的相對量，但是長序列和高GC含量的序列會被低估，表明PCR對群落分析還具有較為顯著的影響。在16S rRNA V6序列的測序中，BIPES方法單個run測得的序列數(shù)是焦磷酸測序的20-50倍，通量高;而且每條BIPES序列的成本不到一條焦磷酸序列的1/40，成本低;同時，BIPES以獲得的16S rRNA V6可變區(qū)作為分類單元的特征，可進(jìn)一步做系統(tǒng)分類和比較，準(zhǔn)確性較好。作為一個高性價比方法，BIPES

8、可以被廣泛用于環(huán)境和人微生物組的微生物群落結(jié)構(gòu)研究。
　　 在獲得大量的序列后，為了進(jìn)一步分析序列所代表的群落結(jié)構(gòu)，進(jìn)而進(jìn)行α和β多樣性比較，需進(jìn)行大量的生物信息學(xué)分析。其中第一步需要將序列進(jìn)行比對，進(jìn)而將一定相似度的序列聚類成可操作分類單元(OTU)，該步驟是分析微生物多樣性生物信息學(xué)的關(guān)鍵步驟。本研究建立了一種新的兩階段聚類(Two-stage-clustering，TSC)方法，能夠降低運算資源的需求，并且具有很好的準(zhǔn)確性

9、。TSC根據(jù)豐度將序列分成兩組之后分別聚類。由于微生物群落本身的分布特征以及高通量測序錯誤發(fā)生的特點，造成測序結(jié)果中高頻數(shù)序列少，而低頻數(shù)序列多。我們對高豐度組采用嚴(yán)謹(jǐn)?shù)姆謱泳垲愃惴?hierarchical)聚類，該算法準(zhǔn)確性高，但其運算隨序列數(shù)量成幾何技術(shù)增長。而我們的TSC算法有效控制了分層聚類比對序列的數(shù)量。其后，我們對包含大部分稀有序列的低頻數(shù)組采用貪婪的啟發(fā)式法(greedy heuristic)聚類以提高效能。其中全部的比

10、對均基于準(zhǔn)確性最高的全局比對算法(Needleman-Wunsch算法)，以獲得準(zhǔn)確的OTU聚類。為進(jìn)一步提高計算效能和準(zhǔn)確度，TSC采用了兩步不同的預(yù)聚類。Clone43_97up數(shù)據(jù)分析結(jié)果顯示TSC能準(zhǔn)確的聚類已知數(shù)據(jù)，得到43個OTU。通過分析一組序列數(shù)約為11萬的真實數(shù)據(jù)Costello day3，結(jié)果顯示TSC只需消耗370s和185M的內(nèi)存即可完成聚類過程，除UCLUST外，其它方法所需的時間和內(nèi)存分別是TSC的10倍以上

11、和5倍以上。本研究發(fā)現(xiàn)，將序列分成兩組之后再聚類不僅提高了計算效能，而且減少由“噪音”序列組成的不合理OTU，這種OTU的特點是低豐度序列可連接高豐度序列，即ARA(abundant-rare-abundant)，經(jīng)深入分析發(fā)現(xiàn)，TSC三種算法聚類所得的OTU中不存在ARA，而ARA在其它方法中的比例分別是:SLP4.2％、UCLUST3.0％、Mothur CL2％、Mothur AL2.3％、Mothur SL45.5％、ESPRI

12、T-SL22％。稀疏曲線分析結(jié)果顯示TSC所得曲線比UCLUST和采用AL的算法更低更平緩。另外，經(jīng)DCA和PCoA分析不同方法聚類Costello數(shù)據(jù)所得OTU對數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)比較的影響，結(jié)果顯示TSC、UCLUST和ESPRIT-AL均能良好的把口腔、腸道樣品分開。同時，一組未發(fā)表的數(shù)據(jù)的分析結(jié)果顯示TSC能顯示地點和溫度是影響樣品群落的兩個因素，而UCLUST只能提示溫度是唯一的影響因素。這兩組數(shù)據(jù)的分析結(jié)果說明，一般情況下，TSC和U

13、CLUST得到相似的beta多樣性比較結(jié)果，但是有時候TSC方法得到的beta多樣性比較效果要比UCLUST要略微好一些。本研究認(rèn)為在PCR擴(kuò)增子的高通量測序的分析中，測序數(shù)據(jù)的分布特征是提高計算效能和準(zhǔn)確度的一個非常有用的要素。
　　 最后，我們用本方法分析一組抗生素數(shù)據(jù)以展示BIPES分析的完整流程，在本組數(shù)據(jù)分析中，BIPES的質(zhì)控作用可剔除7-22％的低質(zhì)序列。α多樣性分析結(jié)果顯示day0樣品的微生物多樣性最豐度，而且d

14、ay3-7樣品多樣性高于day14-21。B多性分析結(jié)果顯示時間和抗生素濃度是影響微生物群落結(jié)構(gòu)的主要因素。
　　 本論文建立了通過Illumina測序，分析微生物群落多樣性的分析流程。我們建立了BIPES技術(shù)，可以獲得高質(zhì)量的V6序列，我們開發(fā)了TSC算法，可以運算百萬數(shù)量水平的序列，獲得準(zhǔn)確的聚類結(jié)果。同時，該聚類序列數(shù)據(jù)可通過GAST, RDP等工具進(jìn)一步進(jìn)行系統(tǒng)分類，獲得樣品中的微生物種類，以及各種類的相對數(shù)量。根據(jù)聚類