雜交稻親本SSR指紋圖譜構(gòu)建及兩系雜交稻和大青棵鑒定的研究.pdf

1、種子的真實(shí)性和純度是種子質(zhì)量檢驗(yàn)的最主要的質(zhì)量指標(biāo)之一。植物新品種特異性(Distinctness)、一致性(Uniformity)和穩(wěn)定性(Stability)的測(cè)試(簡(jiǎn)稱DUS測(cè)試)是農(nóng)業(yè)部植物新品種保護(hù)辦公室對(duì)申請(qǐng)品種授予新品種權(quán)進(jìn)行實(shí)質(zhì)審查最重要的工作內(nèi)容。水稻是我國(guó)主要的糧食作物，雜交稻具有雜種優(yōu)勢(shì)，產(chǎn)量高，抗性好，其種植面積已占我國(guó)水稻面積的一半。我國(guó)是世界上最大雜交水稻種子生產(chǎn)國(guó)和消費(fèi)國(guó)，申請(qǐng)水稻新品種保護(hù)的品種數(shù)量在逐年

2、增加，是我國(guó)目前品種權(quán)申請(qǐng)保護(hù)的主要對(duì)象之一。然而，目前種子的真實(shí)性和純度檢測(cè)和植物新品種DUS測(cè)試均是田間種植方法鑒定。該方法周期長(zhǎng)，費(fèi)工占地，用于測(cè)試的標(biāo)記性狀有限，不能滿足種子市場(chǎng)銷售，新品種及時(shí)授權(quán)的需要，研究快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確的DNA分子標(biāo)記技術(shù)鑒定水稻品種對(duì)于雜交水稻種子質(zhì)量檢測(cè)和新品種授權(quán)具有重要意義。為運(yùn)用SSR分子標(biāo)記快速、準(zhǔn)確鑒定江蘇省地區(qū)范圍內(nèi)生產(chǎn)上的雜交水稻種子的真實(shí)性和純度，需要考慮以下幾個(gè)重點(diǎn)問(wèn)題：快速、高效的

3、DNA提取方法是分子標(biāo)記鑒定品種的頸瓶技術(shù)，傳統(tǒng)的DNA提取方法技術(shù)難度大、操作步驟繁瑣，是分子標(biāo)記品種鑒定技術(shù)不能普及的主要問(wèn)題之一；兩系雜交稻母本的不育性易受光照時(shí)間和溫度的影響，兩系雜交稻會(huì)因不同年份或地區(qū)光、溫條件的變化導(dǎo)致母本自交結(jié)實(shí)而嚴(yán)重影響種子純度，但在海南的種植鑒定中，不育系有時(shí)表現(xiàn)可育，給形態(tài)鑒定帶來(lái)一定的困難；長(zhǎng)江中下游地區(qū)是秈、粳雜交稻和常規(guī)稻均有種植的地區(qū)，在該地區(qū)的雜交稻制種田中經(jīng)常出現(xiàn)秈稻不育系與粳稻父本或粳

4、稻不育系與秈稻父本雜交的一種秈粳亞種雜交組合“大青棵”，這種雜株植株高大，抽穗期晚，雜交稻中大青棵是嚴(yán)重影響企業(yè)形象和產(chǎn)量的雜株類型，但海南種植鑒定時(shí)，大青棵受光溫影響不一定表現(xiàn)植株高大、抽穗期晚等特征，因此難以準(zhǔn)確鑒別。為此，本論文擬從以下4個(gè)方面開(kāi)展研究：一是改進(jìn)DNA提取方法和步驟，研究快速、高效，并獲得高質(zhì)量的DNA提取方法。二是對(duì)生產(chǎn)上推廣的4個(gè)兩系雜交稻和1雜交粳稻的7親本進(jìn)行多態(tài)性分析，并應(yīng)用SSR多態(tài)性標(biāo)記鑒定兩系雜交組

5、合。三是建立近幾年來(lái)生產(chǎn)上常用的33份秈粳雜交稻親本DNA指紋數(shù)據(jù)庫(kù)，并對(duì)這些親本進(jìn)行遺傳相似性分析，為雜交稻種子純度鑒定提供依據(jù)。四是選用了該地區(qū)的常用秈粳不育系與粳秈父本配制了55個(gè)秈粳亞種間雜交組合，考察了F1代株高、抽穗期和結(jié)實(shí)率等主要農(nóng)藝性狀，篩選用于鑒定本試驗(yàn)所配制的秈粳雜交大青棵組合類型雜株的SSR分子標(biāo)記，為該地區(qū)雜交稻中可能出現(xiàn)的大青棵的鑒定提供了依據(jù)。獲得的主要結(jié)果如下：
　　 1.改進(jìn)了DNA提取方法。本研

6、究應(yīng)用了常規(guī)方法的DNA提取方法，同時(shí)也研究應(yīng)用了改進(jìn)了DNA提取方法。在改進(jìn)的DNA提取方法中，無(wú)需使用液氮，而將幼苗葉片放在真空冷凍干燥儀冷凍干燥2～3天，每個(gè)試管里盛放一小鋼珠球，使用研磨儀粉碎葉片組織。由于樣品分別在單獨(dú)的試管里進(jìn)行研磨，避免了交叉污染。在試驗(yàn)過(guò)程中，使用96孔聯(lián)體試管板，而不是單個(gè)離心試管，使用排槍代替單槍操作，CTAB方法提取DNA。通過(guò)多次試驗(yàn)比較，這種方法是一種快速、高效并獲得高質(zhì)量的DNA的提取方法。按

7、照該方法操作，每人每天可提取上千個(gè)DNA樣品。
　　 2.通過(guò)4對(duì)SSR引物組合可以鑒定兩優(yōu)培九、兩優(yōu)108、培矮64S/E32和兩優(yōu)1224個(gè)生產(chǎn)上常用兩系雜交稻。
　　 選用52對(duì)SSR引物對(duì)以培矮64S為母本的4個(gè)兩系雜交稻組合的5個(gè)親本DNA多態(tài)性進(jìn)行了分析，并以1個(gè)雜交粳稻86優(yōu)8號(hào)作為對(duì)照。結(jié)果表明：46對(duì)引物能在7個(gè)親本間擴(kuò)增出多態(tài)性條帶。8對(duì)引物能將4個(gè)兩系雜交稻與對(duì)照雜交粳稻區(qū)分開(kāi)且在86優(yōu)8號(hào)的親本中

8、具有多態(tài)性，可區(qū)分兩優(yōu)培九、兩優(yōu)108、培矮64S/E32、兩優(yōu)122和86優(yōu)8號(hào)F1及其親本的SSR引物分別為34、32、31、30和14對(duì)，有16對(duì)SSR引物均可用于區(qū)分4個(gè)兩系雜交組合F1和親本，RM206和RM286引物可區(qū)分本試驗(yàn)的5個(gè)組合和各自的親本。應(yīng)用其中一對(duì)引物RM505對(duì)兩優(yōu)培九進(jìn)行鑒定驗(yàn)證，結(jié)果表明該引物能準(zhǔn)確區(qū)分兩優(yōu)培九及其親本。根據(jù)本試驗(yàn)中引物的多態(tài)性和特異性的結(jié)果，有多種途徑可鑒別這4個(gè)兩系雜交組合?？赏ㄟ^(guò)R

9、M13(或RM206、RM286等)、RM224(或RM337)、RM234(或RM252、RM505和RM565)和RM25(或RM217、RM248和RM585)等4對(duì)引物將兩優(yōu)培九、兩優(yōu)108、培矮64S/E32和兩優(yōu)122分別加以鑒別。
　　 3.建立了33個(gè)秈、粳雜交稻親本的SSR指紋圖譜數(shù)據(jù)庫(kù)，發(fā)現(xiàn)了6對(duì)可以用于鑒定秈、粳類型的SSR特征標(biāo)記。
　　 選用分布在12條染色體上的84對(duì)SSR引物對(duì)5個(gè)粳型核質(zhì)互

10、作雄性不育系、4個(gè)秈型核質(zhì)互作雄性不育系和1個(gè)溫敏雄性不育系、14個(gè)秈型父本和9個(gè)粳型父本共33份材料進(jìn)行遺傳相似性分析，并建立SSR指紋圖譜數(shù)據(jù)庫(kù)。結(jié)果表明：在33份親本中能夠擴(kuò)增出多態(tài)性的引物為54對(duì)，占所用引物的64.3％。33份親本間的遺傳相似系數(shù)變異范圍為0.40～0.99。在遺傳相似系數(shù)0.66處，33份親本被聚為3個(gè)類群，培矮64S和岡46A為第Ⅰ類群，17個(gè)秈稻親本為第Ⅱ類群，14個(gè)粳稻親本為第Ⅲ類群。在秈、粳亞種內(nèi)，不

11、育系和可育品種又分為不同的亞群，基于SSR分子標(biāo)記的聚類分析結(jié)果與與育種家提供的秈粳分類信息基本一致，進(jìn)一步表明SSR指紋圖譜可以用于鑒定品種。利用18對(duì)引物能將33份親本區(qū)分開(kāi)，RM264能將Ⅱ-32A、協(xié)青早A、岡46A和K17A4個(gè)秈型不育系與秈型可育品種區(qū)別開(kāi)，RM432能將5個(gè)粳型不育系與粳型可育品種區(qū)別開(kāi)。6對(duì)引物RM6、RM13、RM16、RM240、RM247和RM248均為鑒別秈、粳亞種類型的特異引物，利用這6個(gè)標(biāo)記可

12、以鑒別秈型不育系串入粳稻花粉或粳型不育系串入秈稻花粉所產(chǎn)生的秈粳雜株類型。
　　 4.發(fā)現(xiàn)了可以用于本研究大青棵鑒定的SSR分子標(biāo)記。有6對(duì)引物均可用于以六千辛A為母本的大青棵的鑒定，RM9或RM218可用于以Ⅱ-32A為母本的大青棵的鑒定，RM50和RM11等2個(gè)引物組合可用于以9522A為母本的大青棵的鑒定。
　　 研究了55個(gè)秈稻不育系與粳稻父本、粳稻不育系與秈稻父本雜交組合的主要農(nóng)藝性狀及其SSR分子標(biāo)記特征，以

13、具備株高135cm以上、抽穗期121天以上特征的組合作為大青棵類型。結(jié)果表明：38個(gè)粳型不育系與秈稻父本的雜交后代中，以9522A為母本的雜交組合中只有9522A/紫尖秈-1是大青棵組合，以六千辛A為母本的8個(gè)組合均為大青棵組合；17個(gè)秈型不育系和粳稻父本的雜交后代中，以Ⅱ-32A為母本的雜交組合中，僅有Ⅱ-32A/C57，其余秈稻不育系為母本與粳稻父本的雜交組合均不是大青棵。與雜交F1代株高顯著相關(guān)的標(biāo)記的引物有RM9、RM283、R

14、M429、RM515和RM483，其中RM9、RM283、RM429和RM515的標(biāo)記與株高極顯著相關(guān)；與抽穗期顯著相關(guān)的標(biāo)記的引物有RM9、RM44、RM206、RM152、RM276、RM228、RM515、RM211、RM432、RM454，其中RM9、RM44、RM206、RM152、RM515、RM211、RM432、RM454的標(biāo)記與抽穗期極顯著相關(guān)。根據(jù)是否同時(shí)具備秈型和粳型特異性標(biāo)記來(lái)鑒定是否是秈粳亞種間雜交組合。在以9

15、522A為母本的雜交組合中，大青棵可以通過(guò)RM50和RM11(或RM25、RM152、RM228、RM251、RM252、RM286、RM302、RM415)2個(gè)引物組合加以鑒定。以Ⅱ-32A為母本的4個(gè)組合中，Ⅱ-32A/C57大青棵可以通過(guò)RM9或RM218加以鑒定。因本研究中以六千辛A為母本所配制的組合均是大青棵，可以通過(guò)RM9、RM152、RM279、RM413、RM415和RM4296對(duì)引物中的任一個(gè)與其他粳稻不育系為母本的組