體外培養(yǎng)和分子生物學(xué)技術(shù)研究奶牛產(chǎn)后子宮內(nèi)菌群的動態(tài)變化.pdf

1、子宮內(nèi)膜炎是奶牛產(chǎn)后常見的繁殖疾病，常造成子宮和卵巢機能恢復(fù)減慢，產(chǎn)犢間隔延長，受胎率下降，淘汰率上升等，嚴(yán)重影響了奶牛生產(chǎn)的經(jīng)濟效益.為了給臨床診斷和治療提供更多的理論依據(jù)，本試驗通過體外培養(yǎng)和分子生物學(xué)方法集中研究了奶牛產(chǎn)后子宮內(nèi)菌群的動態(tài)變化及其與子宮頸粘液性狀的關(guān)系。
　　 一奶牛產(chǎn)后子宮內(nèi)菌群動態(tài)變化及子宮粘液性狀與細(xì)菌種類關(guān)系的研究
　　 選取分娩日期臨近、產(chǎn)后子宮粘液性狀不同的荷斯坦奶牛42頭，于分娩后第1

2、0d、20 d、30d和40 d采集子宮粘液，微生物體外培養(yǎng)的方法研究奶牛產(chǎn)后子宮內(nèi)優(yōu)勢菌群隨時間的動態(tài)變化及細(xì)菌種類與子宮粘液性狀之間的關(guān)系，以便于臨床的快速診斷及治療。結(jié)果顯示，奶牛產(chǎn)后子宮內(nèi)分離率最高的細(xì)菌為大腸桿菌(85.7％)、變形桿菌(64.3％)和葡萄球菌(61.9％);白色或米白色粘液、黃色或土黃色粘液中每頭牛細(xì)菌分離株數(shù)（5.56±0.38，5.50±1.40）高于清亮透明粘液（3.48±1.58），其中沙門氏菌、變形

3、桿菌、鏈球菌和化膿隱秘桿菌產(chǎn)后30 d和40 d可能與白色或黃色膿性粘液的出現(xiàn)相關(guān);產(chǎn)后40 d黃色或土黃色化膿性粘液的出現(xiàn)可能與產(chǎn)氣莢膜梭菌的出現(xiàn)相關(guān);而糞腸球菌和嗜酸乳桿菌產(chǎn)后10 d清亮粘液中分離數(shù)較不正常粘液高，產(chǎn)后30d和40 d在膿性粘液中分離數(shù)高于清亮粘液，說明其作為有益菌可能在分泌不正常粘液的子宮內(nèi)具有抵抗病原菌的作用。研究結(jié)果表明奶牛產(chǎn)后子宮內(nèi)優(yōu)勢菌群呈動態(tài)變化，子宮粘液性狀與特異病原菌的出現(xiàn)相關(guān)，為臨床治療藥物種類和

4、劑量選擇提供了理論依據(jù).
　　 二奶牛產(chǎn)后子宮內(nèi)細(xì)菌多樣性的研究
　　 采集健康和子宮內(nèi)膜炎奶牛產(chǎn)后10 d和40 d子宮粘液，利用細(xì)菌通用引物8F/151(0)R，建立其16S rRNA基因克隆庫，研究產(chǎn)后不同時間、不同生理狀態(tài)奶牛子宮內(nèi)菌群多樣性。試驗共挑取297個克隆，結(jié)果發(fā)現(xiàn)奶牛產(chǎn)后子宮內(nèi)細(xì)菌主要屬于Bacteroidetes、Fusobacteria、Firmicutes、Tenericutes和Proteab

5、acteria。產(chǎn)后10d健康奶牛(H10)和子宮內(nèi)膜炎奶牛(M10)克隆序列均主要來自于Bacteroidetes、 Fusobacteria和Firmicutes，所占比例及最相似菌具有差異。H10的71個克隆中64個(90.14％)屬于Bacteroidetes，序列比對分析顯示有36個(50.70％)最相似于Bacteroides pyogenes; M10的79個克隆中52個(65.82％)屬于Bacteroidetes，其中

6、31個(39.24％)最相似于Bacteroides heparinolyticus;17個(21.52％)屬于Firmicutes細(xì)菌中11個(13.92％)最相似于Peptostreptococcus sp.，結(jié)果提示Bacteroidesheparinolyticus和Peptostreptococcus.sp.可能是引起子宮內(nèi)膜炎的主要病原菌.產(chǎn)后40d健康奶牛(H40) Bacteroidetes克隆數(shù)量較產(chǎn)后10d明顯下降（

7、5個，7.14％），克隆序列主要屬于Tenericutes(39個，55.71％)，全部最相似于Ureaplasma diversum(98％);產(chǎn)后40 d子宮內(nèi)膜炎奶牛(M40)77個克隆中32個(42.86％)屬于Firmicutes，16個最相似于Parvimonas sp.(95～96％);26個(33.77％)屬于Proteabacteria的克隆均最相似于Histophilus somni(99～100％)。結(jié)果表明，H4

8、0菌群多樣性較H10下降，Tenericutes細(xì)菌成為子宮內(nèi)優(yōu)勢菌群;M40中Bacteroidetes克隆仍維持較高數(shù)量，新增Proteabacteria門克隆。結(jié)果提示Bacteroidetes門和Proteabacteria門的部分細(xì)菌可能是導(dǎo)致子宮復(fù)原時間延長的主要細(xì)菌。
　　 三奶牛產(chǎn)后子宮內(nèi)菌群結(jié)構(gòu)和數(shù)量的研究
　　 選取產(chǎn)后健康(H)和子宮內(nèi)膜炎(M)奶牛各3頭，采集產(chǎn)后10d、20 d、30d和40 d

9、子宮粘液，運用基于16S rRNA基因的PCR/DGGE技術(shù)和Real-time PCR定量技術(shù)探討奶牛產(chǎn)后子宮內(nèi)菌群結(jié)構(gòu)和數(shù)量變化及不同性狀粘液子宮內(nèi)菌群結(jié)構(gòu)。DGGE結(jié)果表明，壞死梭桿菌（Fusobacterium necrophorum）、解肝素擬桿菌（Bacteroides heparinolyticus）和普雷沃氏菌屬（Prevotella sp.）產(chǎn)后30d，化膿隱秘桿菌（Arcanobacterium pyogenes）產(chǎn)

10、后40 d只出現(xiàn)子宮內(nèi)膜炎奶牛子宮內(nèi)，可能為子宮內(nèi)膜炎致病菌;健康奶牛子宮內(nèi)較子宮內(nèi)膜炎奶牛更早出現(xiàn)棒狀桿菌屬（Corynebacterium sp.），可能為子宮內(nèi)有益菌群;相似性分析發(fā)現(xiàn)H組10d與M組10～40 d之間具有較高的相似性，說明子宮內(nèi)膜炎奶牛產(chǎn)后20、30和40天子宮內(nèi)菌群結(jié)構(gòu)沒有因自凈而改變，可能是子宮疾病的原因之一。壞死梭桿菌與棕黑色、黃色或白色等不正常粘液相關(guān)，解肝素擬桿菌和普雷沃氏菌與白色或黃色粘液出現(xiàn)相關(guān)，化

11、膿隱秘桿菌產(chǎn)后40 d與白色粘液相關(guān)，相同性狀粘液間具有較高相似性.定量結(jié)果表明H組總細(xì)菌、消化鏈球菌屬和梭桿菌屬細(xì)菌數(shù)量產(chǎn)后30和40天較產(chǎn)后10天均顯著降低，M組產(chǎn)后10d和30d三種細(xì)菌數(shù)量均顯著高于H組，總細(xì)菌、消化鏈球菌屬和梭桿菌屬細(xì)菌數(shù)量可能是導(dǎo)致子宮內(nèi)膜炎的一個原因;H組和M組擬桿菌隨時間均顯著降低，M組產(chǎn)后10d顯著高于H組，但H組擬桿菌占總菌比例產(chǎn)后30d恢復(fù)至30％左右，說明擬桿菌屬細(xì)菌中部分有益菌的大量增殖可能有利