河北省規(guī)?；i場JEV毒株的分享鑒定及進化分析.pdf

1、流行性日本乙型腦炎(Japanese encephalitis，JE)是由日本乙型腦炎病毒(Japanese encephalitis virus，JEV)引起的一種以蚊子為主要傳播媒介的人畜共患的自然疫源性疾病。JEV具有神經(jīng)毒性能造成人的神經(jīng)系統(tǒng)疾患，發(fā)生十分嚴重的后果，對豬則造成母豬死胎、木乃伊胎、流產(chǎn)，公豬睪丸炎等繁殖障礙性疾病。雖然本病對豬的致死率不高，但能夠嚴重損害養(yǎng)豬業(yè)的經(jīng)濟利益，是養(yǎng)豬業(yè)最重要的繁殖障礙性疾病之一。蚊子是

2、乙型腦炎流行主要的傳播媒介，而豬則是JEV最重要的增殖宿主和儲存宿主。本研究從河南規(guī)?；N豬場中采集19例疑似乙型腦炎病例的公豬精液樣本進行JEV的分離鑒定及分子進化分析，旨在深入研究乙型腦炎在河南省規(guī)?；N豬場的流行病學情況，對有效控制豬群乙型腦炎的大規(guī)模流行提供科學依據(jù)。
　　 本研究首先參考GenBank中已報道的JEV M、E基因序列，利用DNAstar5.0軟件進行同源性分析并找出保守序列，用Primer Premie

3、r5.0軟件設計2對特異針對JEVE基因和M基因的引物。采用RT-PCR方法對采集的精液樣品進行初步鑒定，提取采集的疑似乙型腦炎病例的材料的總RNA為模板進行RT反應，應用設計的特異引物對JEV M、E基因進行PCR擴增，最終從19份豬精液樣品中成功分離出2株JEV。乳鼠攻毒實驗表明，用種豬精液上清經(jīng)腦內接種3日齡乳鼠，接種72h后發(fā)病鼠出現(xiàn)四肢僵硬、頭向一側扭曲等典型神經(jīng)癥狀。對攻毒乳鼠腦組織進行RT-PCR擴增JEV的M和E基因，結

4、果試驗鼠和陽性對照均擴增出與預期大小相符的2種PCR產(chǎn)物，陰性對照小鼠則無條帶。測序結果表明這2種PCR產(chǎn)物分別為JEV M或E基因，與之前測序結果完全一致，這表明本實驗從種豬精液中成功分離到的2個JEV毒株，將其分別命名為BSF.ZZ-1和BSF.ZZ-3。
　　 用BSF.ZZ-1和BSF.ZZ-3攻毒乳鼠腦組織毒接種BHK-21細胞，于接毒后60 h用抗JEV E蛋白單抗進行間接免疫熒光鑒定。結果顯示，2個毒株感染后的BH

5、K-21細胞中均超過半數(shù)細胞的胞漿內呈現(xiàn)明顯的特異性熒光染色，而陰性對照細胞則無熒光，進一步證實本實驗分離的毒株為JEV毒株。用BHK-21細胞對新分離毒株進行體外培養(yǎng)，感染72 h后分別取樣進行病毒效價測定。結果顯示，BSF.ZZ-1和BSF.ZZ-3的第1代細胞培養(yǎng)物的病毒效價均較低，分別為103.2±0.2 TCID50/mL和101.6±0.1 TCID50/mL，隨后繼續(xù)傳代病毒量均獲得明顯增加，最高病毒量分別可達104.5±

6、0.1TCID50/mL和104.2±0.2TCID50/mL。
　　 本研究最后對新分離的JEV毒株進行基因進化樹的構建及分析，采用國外及國內分離到的SA14、SA14-14-2、Ha-3等共計17株，屬于4種不同基因亞型的JEV分離株的M和E基因為參考序列分別構建JEV M基因和E基因進化樹，對新分離的2株JEV進行遺傳進化分析。結果表明，19個JEV毒株分別分布于4種不同的進化分支，新分離的BSF.ZZ-1和BSF.ZZ-