河北省規(guī)?；i場(chǎng)JEV毒株的分享鑒定及進(jìn)化分析.pdf

1、流行性日本乙型腦炎(Japanese encephalitis，JE)是由日本乙型腦炎病毒(Japanese encephalitis virus，JEV)引起的一種以蚊子為主要傳播媒介的人畜共患的自然疫源性疾病。JEV具有神經(jīng)毒性能造成人的神經(jīng)系統(tǒng)疾患，發(fā)生十分嚴(yán)重的后果，對(duì)豬則造成母豬死胎、木乃伊胎、流產(chǎn)，公豬睪丸炎等繁殖障礙性疾病。雖然本病對(duì)豬的致死率不高，但能夠嚴(yán)重?fù)p害養(yǎng)豬業(yè)的經(jīng)濟(jì)利益，是養(yǎng)豬業(yè)最重要的繁殖障礙性疾病之一。蚊子是

2、乙型腦炎流行主要的傳播媒介，而豬則是JEV最重要的增殖宿主和儲(chǔ)存宿主。本研究從河南規(guī)模化種豬場(chǎng)中采集19例疑似乙型腦炎病例的公豬精液樣本進(jìn)行JEV的分離鑒定及分子進(jìn)化分析，旨在深入研究乙型腦炎在河南省規(guī)模化種豬場(chǎng)的流行病學(xué)情況，對(duì)有效控制豬群乙型腦炎的大規(guī)模流行提供科學(xué)依據(jù)。
　　 本研究首先參考GenBank中已報(bào)道的JEV M、E基因序列，利用DNAstar5.0軟件進(jìn)行同源性分析并找出保守序列，用Primer Premie

3、r5.0軟件設(shè)計(jì)2對(duì)特異針對(duì)JEVE基因和M基因的引物。采用RT-PCR方法對(duì)采集的精液樣品進(jìn)行初步鑒定，提取采集的疑似乙型腦炎病例的材料的總RNA為模板進(jìn)行RT反應(yīng)，應(yīng)用設(shè)計(jì)的特異引物對(duì)JEV M、E基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，最終從19份豬精液樣品中成功分離出2株JEV。乳鼠攻毒實(shí)驗(yàn)表明，用種豬精液上清經(jīng)腦內(nèi)接種3日齡乳鼠，接種72h后發(fā)病鼠出現(xiàn)四肢僵硬、頭向一側(cè)扭曲等典型神經(jīng)癥狀。對(duì)攻毒乳鼠腦組織進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增JEV的M和E基因，結(jié)

4、果試驗(yàn)鼠和陽(yáng)性對(duì)照均擴(kuò)增出與預(yù)期大小相符的2種PCR產(chǎn)物，陰性對(duì)照小鼠則無(wú)條帶。測(cè)序結(jié)果表明這2種PCR產(chǎn)物分別為JEV M或E基因，與之前測(cè)序結(jié)果完全一致，這表明本實(shí)驗(yàn)從種豬精液中成功分離到的2個(gè)JEV毒株，將其分別命名為BSF.ZZ-1和BSF.ZZ-3。
　　 用BSF.ZZ-1和BSF.ZZ-3攻毒乳鼠腦組織毒接種BHK-21細(xì)胞，于接毒后60 h用抗JEV E蛋白單抗進(jìn)行間接免疫熒光鑒定。結(jié)果顯示，2個(gè)毒株感染后的BH

5、K-21細(xì)胞中均超過(guò)半數(shù)細(xì)胞的胞漿內(nèi)呈現(xiàn)明顯的特異性熒光染色，而陰性對(duì)照細(xì)胞則無(wú)熒光，進(jìn)一步證實(shí)本實(shí)驗(yàn)分離的毒株為JEV毒株。用BHK-21細(xì)胞對(duì)新分離毒株進(jìn)行體外培養(yǎng)，感染72 h后分別取樣進(jìn)行病毒效價(jià)測(cè)定。結(jié)果顯示，BSF.ZZ-1和BSF.ZZ-3的第1代細(xì)胞培養(yǎng)物的病毒效價(jià)均較低，分別為103.2±0.2 TCID50/mL和101.6±0.1 TCID50/mL，隨后繼續(xù)傳代病毒量均獲得明顯增加，最高病毒量分別可達(dá)104.5±

6、0.1TCID50/mL和104.2±0.2TCID50/mL。
　　 本研究最后對(duì)新分離的JEV毒株進(jìn)行基因進(jìn)化樹的構(gòu)建及分析，采用國(guó)外及國(guó)內(nèi)分離到的SA14、SA14-14-2、Ha-3等共計(jì)17株，屬于4種不同基因亞型的JEV分離株的M和E基因?yàn)閰⒖夹蛄蟹謩e構(gòu)建JEV M基因和E基因進(jìn)化樹，對(duì)新分離的2株JEV進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析。結(jié)果表明，19個(gè)JEV毒株分別分布于4種不同的進(jìn)化分支，新分離的BSF.ZZ-1和BSF.ZZ-