黃瓜芽黃突變相關(guān)基因ClpP的克隆及其功能分析.pdf

1、目的：（1）以正常黃瓜(Cucumis sativus L.)（新泰密刺）和芽黃突變體黃瓜（新泰密刺）為研究對(duì)象，篩選正常與芽黃突變體黃瓜中的ClpP基因，分析其核酸序列并預(yù)測(cè)相關(guān)蛋白的結(jié)構(gòu)和功能。為后期研究芽黃相關(guān)基因ClpP的作用機(jī)制提供目標(biāo)序列和研究基礎(chǔ)。（2）構(gòu)建芽黃相關(guān)基因ClpP的植物表達(dá)載體，并進(jìn)行該基因?qū)煵莸倪z傳轉(zhuǎn)化，通過(guò)生理性狀分析該基因功能。
　　 方法：（1）分別提取正常黃瓜和芽黃突變體黃瓜不同生長(zhǎng)時(shí)期葉

2、片的總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，采用特異性引物PCR擴(kuò)增得到芽黃相關(guān)基因ClpP的cDNA序列核心序列，連接到pGEM-T載體后測(cè)序，測(cè)序結(jié)果經(jīng)Blaxtn和GenBank公共數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)分析。（2）含目的片段的pGEM-T載體和農(nóng)桿菌EhA105經(jīng)雙酶切后分別獲得目的條帶和表達(dá)載體，用連接酶連接獲得重組子后經(jīng)電擊轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌并用該農(nóng)桿菌侵染煙草愈傷組織。愈傷組織誘導(dǎo)分化發(fā)芽后，觀察其生理性狀分析其功能。
　　 結(jié)果:（1

3、）經(jīng)測(cè)序后得到正常黃瓜和芽黃突變體ClpP基因序列為494bp?？删幋a164個(gè)氨基酸。從1到132氨基酸之間有S14_ClpP_2保守結(jié)構(gòu)域，沒(méi)有信號(hào)肽，推測(cè)其可能不是分泌蛋白。與預(yù)測(cè)的黃瓜葉綠體合成全基因組比對(duì)發(fā)現(xiàn)，該基因有三個(gè)外顯子，二個(gè)內(nèi)含子組成，但本研究只獲得了兩個(gè)外顯子序列。將該基因氨基酸序列與其他七種植物的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，并進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，發(fā)現(xiàn)黃瓜最先和毛茛屬植物（Ranunculus macranthus）聚類，再和

4、擬南芥1（Arabidopsis thaliana）聚類。（2）攜帶正常和芽黃黃瓜的ClpP基因的農(nóng)桿菌介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化獲得的煙草均未出現(xiàn)明顯的芽黃現(xiàn)象。
　　 結(jié)論：（1）正常黃瓜與芽黃突變體的ClpP基因序列與結(jié)構(gòu)完全相同，他們含有相同的高度保守的結(jié)構(gòu)域S14_ClpP_2，在黃瓜芽黃現(xiàn)象中該基因可能在調(diào)控水平發(fā)揮作用。（2）攜帶正常和芽黃黃瓜的ClpP基因農(nóng)桿菌介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化試驗(yàn)中未獲得出現(xiàn)芽黃現(xiàn)象的煙草植株，這種現(xiàn)象可能有以下