黃瓜稀刺基因的定位、克隆及功能分析.pdf

1、果實刺瘤密度是黃瓜（Cucumis sativus L.）重要的外觀商品性狀。然而到目前為止，還未見調(diào)控黃瓜刺瘤密度的相關(guān)基因被克隆的報道，黃瓜刺瘤密度形成的分子機制仍然未知。因此，對黃瓜稀刺基因定位、克隆，有助于研究黃瓜刺瘤密度形成的分子機制，同時為刺瘤密度分子育種提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。
　　本研究從華北型密刺黃瓜CNS2（wild type, WT）中分離出一個稀刺突變體，few spines1(fs1)。fs1果實刺瘤數(shù)目

2、顯著少于WT，而莖、葉、卷須、花萼等其它部位的表皮毛形態(tài)、密度均無顯著變化，是研究黃瓜果實刺瘤密度形成機理的理想材料。用華北型密刺黃瓜CNS2、9930分別與fs1雜交構(gòu)建了2個F2群體，通過BSA（Bulk Segregant Analysis）法結(jié)合基因組重測序?qū)s1進行了初步定位，然后利用圖位克隆技術(shù)分離出稀刺基因。同時，對密刺表型和稀刺表型果實混池進行轉(zhuǎn)錄組測序，找到了部分受稀刺基因影響的基因。為了研究稀刺基因的功能，還進行了

3、黃瓜的遺傳轉(zhuǎn)化進行互補驗證。具體研究結(jié)果如下：
　　1.構(gòu)建了稀刺突變體和其親本的F2群體，取稀刺和密刺表型個體葉片混池，提取DNA后重測序，將獲得的SNV進行關(guān)聯(lián)分析， fs1被定位到黃瓜6號染色體上。
　　2.由于fs1與WT的基因組相似度較高，在開發(fā)標(biāo)記時未找到合適可用的標(biāo)記來進行下一步的精細定位工作。因此，將 fs1和9930進行雜交，構(gòu)建了新的精細定位群體。利用黃瓜基因組重測序得到的SNP數(shù)據(jù)，找到了4個CAPS標(biāo)

4、記和1個SNP標(biāo)記。用CAPS1和 MM2對5400棵F2單株進行篩選，找到130棵交換個體。用CAPS3、CAPS4和 MM2對32個稀刺表型交換單株進行分析，將稀刺基因fs1定位到了 MM1和 MM2標(biāo)記之間，這兩個標(biāo)記之間的物理距離為110.4 kb，有25個注釋基因。
　　3.通過對候選區(qū)間內(nèi)25個基因的編碼區(qū)和啟動子區(qū)域測序，將WT和fs1的序列進行比對，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Csa6M514870（CsHDZIV11/CsGL3/

5、Tril）的啟動子區(qū)域內(nèi)發(fā)生了片段的替換，WT中10 bp的片段在fs1中被替換成了812 bp。Csa6M514870屬于HD-ZIP IV亞家族，編碼了一個PDF2相關(guān)蛋白。在開花當(dāng)天的果實中，fs1中的Csa6M514870的表達顯著高于WT。這表明，Csa6M514870是最佳候選基因。
　　4.為了進一步分析CsHDZIV11在黃瓜中的功能，進行了黃瓜的遺傳轉(zhuǎn)化。目前已得到20棵再生植株，有待于進一步驗證。
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6、.對稀刺突變體的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進行分析并和已發(fā)表的黃瓜表皮毛相關(guān)轉(zhuǎn)錄組或表達譜數(shù)據(jù)比較，找到了四個可能參與黃瓜刺瘤密度形成調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的基因：Csa5M606310、Csa6M501990、Csa3M101810和Csa3M824990。
　　6.根據(jù)CsHDZIV11的啟動子區(qū)域內(nèi)的片段替換，開發(fā)了一個分子標(biāo)記MM3。經(jīng)檢測，這個標(biāo)記和來自不同地區(qū)不同品種的果實刺瘤密度共分離。另外，這一片段也存在于野生黃瓜（C. sativus var