葡萄應(yīng)答霜霉病過程中VvIPK2作用機(jī)制的研究.pdf

1、近幾年，隨著葡萄種植面積的不斷擴(kuò)大，各地之間插條苗木交換日益頻繁，葡萄病害日漸嚴(yán)重。由葡萄霜霉病菌引起的葡萄霜霉病已成為一種世界性真菌病害，它在葡萄的栽培和生長過程中極易發(fā)生，嚴(yán)重地影響了葡萄的生長和果實(shí)的產(chǎn)量及品質(zhì)。
　　 本論文以對霜霉病不同抗性的2個葡萄品種“左優(yōu)紅”和“霞多麗”一年生健康葉片為材料，利用分子生物學(xué)和植物生理學(xué)試驗(yàn)手段，結(jié)合藥理學(xué)試驗(yàn)，從分子和組織水平分別探討了葡萄多磷酸肌醇激酶(inositolpolyp

2、hosphatekinase，IPK2)基因VvIPK2在葡萄應(yīng)答霜霉病過程中的作用，及其與過氧化氫(hydrogenperoxide，H2O2)、葡萄病原相關(guān)蛋白1基因（VvPR1）、苯丙氨酸解氨酶（phenylalanineammonia-lyase，PAL）和幾丁質(zhì)酶(chitinase，Cht)的關(guān)系，以期為深入了解葡萄抗霜霉病機(jī)制提供依據(jù)。
　　 利用同源克隆法，以葡萄品種“左優(yōu)紅”試管苗為材料，克隆了VvIPK2，測

3、序結(jié)果表明，擴(kuò)增片段大小為918bp，編碼305個氨基酸，ClustalW2軟件分析比較，結(jié)果表明“左優(yōu)紅”VvIPK2編碼產(chǎn)物與GeneBank中提交的“黑比諾”氨基酸序列同源性達(dá)99.7％相同;而與抗性品種“F-242”氨基酸同源性達(dá)98.0％相同。
　　 外施IPK2的抑制劑棉子酚(gossypol)，H2O2及其清除劑抗壞血酸(ascorbicacid，AsA)觀測其在抵御葡萄霜霉病中的作用。發(fā)現(xiàn)0.1％H2O2預(yù)處理后

4、接種葡萄霜霉病菌能提高感病品種“霞多麗”對葡萄霜霉病的抵抗能力，其感病率降低了23.4％;H2O2清除劑AsA或IPK2抑制劑gossypol預(yù)處理后，抗病品種“左優(yōu)紅”葉片感病情況加重，感病率上升。由此可知，H2O2和IPK2均可提高葡萄對葡萄霜霉病的抗性。
　　 以對霜霉病不同抗性的2個葡萄品種“左優(yōu)紅”和“霞多麗”試管苗為材料，利用分子生物學(xué)和植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)手段，結(jié)合藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)，探討了葡萄應(yīng)答霜霉病過程中VvIPK2的作用

5、機(jī)制。結(jié)果表明，接種霜霉病菌后一定時間內(nèi)葡萄葉片VvIPK2相對表達(dá)量增加，PAL和Cht活性升高;IPK2抑制劑能顯著降低葡萄霜霉病菌所引起的抗性品種“左優(yōu)紅”葉片PAL和Cht活性的變化，說明VvIPK2位于的PAL和Cht上游參與葡萄應(yīng)答霜霉病過程。
　　 本論文同時研究了在應(yīng)答葡萄霜霉病中VvIPK2與H2O2的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，接種葡萄霜霉病菌后H2O2含量的上升，外源H2O2及H2O2清除劑AsA和H2O2合成酶抑制劑

6、二苯基碘（dibenziodolium，DPI）能逆轉(zhuǎn)葡萄霜霉病菌所引起的抗性品種“左優(yōu)紅”葉片PAL和Cht活性的變化，且IPK2抑制劑對葡萄霜霉病菌引起的H2O2水平變化沒有影響;清除H2O2可減弱葡萄霜霉病菌對VvIPK2相對表達(dá)量的誘導(dǎo)效應(yīng)。推測，H2O2位于VvIPK2的上游參與葡萄應(yīng)答霜霉病過程。
　　 PR1亦是與植物抗病性密切相關(guān)的病原相關(guān)蛋白，那么PR1是否也參與了由VvIPK2介導(dǎo)的抗病反應(yīng)？利用同源克隆法以

7、“左優(yōu)紅”組培苗葉片為材料，克隆了葡萄病原相關(guān)蛋白基因VvPR1。利用實(shí)時定量PCR檢測了不同處理下的VvPR1的相對表達(dá)量變化，發(fā)現(xiàn)接種霜霉病菌后，VvPR1相對表達(dá)量提高，在24h達(dá)最大值;水楊酸(salicylicacid，SA)、脫落酸(abscisicacid，ABA)、茉莉酸(jasmonateacid，JA)、硫氫化鈉(sodiumhydrosulfide，NaHS)、硝普鈉（sodiumnitroprusside，SNP

8、）能誘導(dǎo)VvPR1的表達(dá)，同時在低溫、鹽脅迫、干旱條件下VvPR1的表達(dá)亦略有升高。IPK2抑制劑、H2O2清除劑及合成酶抑制劑均能減弱葡萄霜霉病菌所引起的抗性品種“左優(yōu)紅”葉片VvPR1相對表達(dá)量變化;外源H2O2能夠上調(diào)VvPR1的表達(dá)。這些結(jié)果說明VvPR1是位于VvIPK2和H2O2下游的參與葡萄應(yīng)答霜霉病的重要病原蛋白。
　　 綜合以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以初步得出結(jié)論，VvIPK2是葡萄抵御霜霉病的重要組分，葡萄應(yīng)答霜霉病的過