不結(jié)球白菜分蘗性狀的發(fā)生機(jī)理及其候選基因挖掘.pdf

1、不結(jié)球白菜(Brassica rapa ssp.chinensis Makino)原產(chǎn)中國(guó)，是十字花科蕓薹屬中重要的蔬菜作物之一。不結(jié)球白菜可以分為五大類(lèi)，分別是:1.普通白菜var.communis(Tsen et Lee) Hanelt，2.塌菜var.rosularis(Tsen et Lee)Hanelt，3.菜薹vat.parachinensis(L.H.Bailey) Hanelt，4.薹菜var.tai-tsai Hort

2、.，5.分蘗菜var.multicepsHort.。其中分蘗菜表現(xiàn)為特殊的多頭分枝特性，在營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)階段即有大量側(cè)枝形成，狀如分蘗，又叫多頭菜。本研究主要以分蘗菜品種‘馬耳頭’和普通白菜品種‘蘇州青’為研究材料，對(duì)分蘗菜的多頭分枝特性進(jìn)行觀察，解剖，測(cè)定內(nèi)源激素含量變化，探討其發(fā)生機(jī)理。構(gòu)建F2分離群體，利用高通量測(cè)序技術(shù)進(jìn)行分蘗性狀相關(guān)的候選基因的挖掘。研究?jī)?nèi)容如下:
　　1不結(jié)球白菜分蘗性狀的特點(diǎn)
　　不結(jié)球白菜的多數(shù)品種

3、在開(kāi)花期會(huì)有大量側(cè)枝從莖基部（一級(jí)分枝）及葉腋之間（二級(jí)分枝）抽出，一般在營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期無(wú)側(cè)枝形成。但不結(jié)球白菜變種之一的分蘗菜在營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)階段即有側(cè)芽從短縮莖基部和成葉間的葉腋處長(zhǎng)出，進(jìn)一步伸長(zhǎng)生長(zhǎng)發(fā)育成為由多片小葉組成的分枝。形態(tài)學(xué)觀察表明，營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)達(dá)到一定階段（10-12片），不結(jié)球白菜分蘗菜中的側(cè)芽開(kāi)始形成并長(zhǎng)出，直到每一個(gè)葉腋處都有一個(gè)側(cè)芽并最終長(zhǎng)成分蘗，具有一片成葉對(duì)應(yīng)一個(gè)分蘗的特點(diǎn)。組織切片觀察顯示，‘蘇州青’和‘馬耳頭’都有腋

4、分生組織的形成，但形成時(shí)期略有不同。‘蘇州青’中腋分生組織形成后進(jìn)入休眠狀態(tài)而‘馬耳頭’中腋分生組織形成后無(wú)休眠過(guò)程直接繼續(xù)發(fā)育并進(jìn)一步形成分蘗。生殖生長(zhǎng)開(kāi)始后，‘蘇州青’中的腋芽結(jié)束休眠也開(kāi)始向外生長(zhǎng)，形成側(cè)枝后開(kāi)花結(jié)果。成株期部分營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)含量測(cè)定結(jié)果顯示，分蘗菜的硝態(tài)氮、可溶性蛋白和VC含量都顯著高于普通白菜。
　　2激素對(duì)不結(jié)球白菜分蘗性狀的影響
　　利用酶聯(lián)免疫反應(yīng)法(ELISA)測(cè)定‘馬耳頭’和‘蘇州青’內(nèi)源激素含

5、量結(jié)果顯示:生長(zhǎng)素主要參與了‘蘇州青’中側(cè)芽的休眠，抑制側(cè)芽向外生長(zhǎng)，是‘蘇州青’中頂端優(yōu)勢(shì)現(xiàn)象起主要作用的激素;細(xì)胞分裂素在‘馬耳頭’分蘗發(fā)生過(guò)程中起主要促進(jìn)作用。對(duì)‘馬耳頭’的根部外施細(xì)胞分裂素(6-BA)和獨(dú)腳金內(nèi)酯（GR24），處理6天后發(fā)現(xiàn)，獨(dú)腳金內(nèi)酯抑制側(cè)芽的發(fā)生和生長(zhǎng)而細(xì)胞分裂素促進(jìn)側(cè)芽的發(fā)生和伸長(zhǎng)。Q-PCR結(jié)果顯示，細(xì)胞分裂素響應(yīng)基因BcRR4和BcRR5在‘馬耳頭’中的增加量顯著高于‘蘇州青’中的增加量，說(shuō)明‘馬耳頭

6、’對(duì)細(xì)胞分裂素的響應(yīng)更敏感;BcBRC1基因在‘馬耳頭’中的表達(dá)量顯著低于‘蘇州青’中的表達(dá)量，說(shuō)明在“細(xì)胞分裂素-獨(dú)腳金內(nèi)酯調(diào)控莖分枝”這一抑制分蘗發(fā)生的調(diào)控途徑中，‘馬耳頭’響應(yīng)機(jī)制劣于‘蘇州青’。
　　3兩雜交組合6個(gè)遺傳群體的數(shù)量遺傳學(xué)分析
　　利用分蘗親本‘馬耳頭’、‘如皋毛菜’和不分蘗親本‘蘇州青’構(gòu)建遺傳群體(P1、P2、F1、F2、BC1和BC2)，對(duì)分蘗數(shù)和葉片數(shù)進(jìn)行主基因+多基因的混合遺傳模型分析。結(jié)果顯

7、示不結(jié)球白菜分蘗數(shù)和葉片數(shù)均符合E-1混合遺傳模型，受2對(duì)加性-顯性-上位性主基因+加性-顯性多基因控制。分蘗性狀不僅受兩對(duì)主基因控制，也受更多微效多基因的遺傳影響。F2中主基因加多基因的遺傳率達(dá)到61.58％～96.83％，說(shuō)明分蘗數(shù)和葉片數(shù)主要由遺傳因素控制，環(huán)境對(duì)分蘗數(shù)和葉片數(shù)的影響穩(wěn)定而微效。遺傳率的高低決定選擇世代的早晚，高遺傳率說(shuō)明早期選擇是有效的。
　　4利用F2群體進(jìn)行BSA-簡(jiǎn)化基因組測(cè)序分析及SSR分子標(biāo)記開(kāi)發(fā)

8、
　　測(cè)定1000株F2群體的分蘗數(shù)，選取分蘗數(shù)分別為0、1-2、5-6、8-9和≥10各50株抽提DNA，形成五份DNA混池并利用限制性?xún)?nèi)切酶Eco RⅠ+MseⅠ酶切后測(cè)序。利用分布在全基因組的SNP標(biāo)記對(duì)五種DNA池進(jìn)行基因型鑒定，篩選在若干DNA混池之間存在多態(tài)性差異的標(biāo)記(Marker)，根據(jù)這些標(biāo)記進(jìn)一步確定與分蘗相關(guān)的候選區(qū)域，對(duì)區(qū)域內(nèi)基因進(jìn)行注釋和q-PCR篩選，進(jìn)一步確定用于做功能驗(yàn)證的基因。根據(jù)簡(jiǎn)化基因組測(cè)序的

9、結(jié)果進(jìn)行與分蘗性狀相關(guān)的分子標(biāo)記的開(kāi)發(fā)，得到9對(duì)SSR分子標(biāo)記。其中有8對(duì)能在親本中擴(kuò)增出較為清晰的條帶，有效引物比例為90％，其中編號(hào)為Bra028643、Bra023312、Bra002958和Bra002957的基因?qū)?yīng)的4對(duì)引物在親本中表現(xiàn)出穩(wěn)定的多態(tài)性,SSR標(biāo)記引物開(kāi)發(fā)成功率為50％。
　　5不結(jié)球白菜分蘗性狀轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析
　　將‘蘇州青’和‘馬耳頭’兩個(gè)時(shí)期的根(R)、莖尖(SAM)和葉片(L)共計(jì)12個(gè)樣本進(jìn)

10、行了無(wú)參轉(zhuǎn)錄組測(cè)序并組裝成一套參考序列。獲得了總長(zhǎng)為120，205，788nt的119，237個(gè)Unigenes，其中得到注釋的基因共計(jì)104，086(87.29％)。獲得了32，065個(gè)SSR標(biāo)記位點(diǎn)。KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)注釋得到3，768(6.25％)個(gè)涉及到激素信號(hào)調(diào)控途徑的基因。將非分蘗期(Stage0)和分蘗期(Stage1)樣本中的基因進(jìn)行差異性表達(dá)分析后發(fā)現(xiàn)，在兩個(gè)種質(zhì)之間及同一品種的不同組織部位之間存在巨大的差異性表達(dá)基因(D