油菜種子油脂基因的定位及溫度對(duì)種子油分積累影響的分子機(jī)制.pdf

1、油菜屬于十字花科蕓薹屬,是產(chǎn)油效率最高的油料作物之一,它不僅是食用油的主要來(lái)源,也是解決全球能源短缺的重要原料作物。油菜種子發(fā)育過(guò)程中的油脂積累和脂肪酸代謝很大程度上存在變異,變異的因?yàn)槌丝刂朴椭铣傻年P(guān)鍵基因以外,也包括應(yīng)對(duì)環(huán)境和內(nèi)源性刺激的大量基因。研究人員和育種家們花費(fèi)了大量的精力鑒定參與油菜油脂形成的關(guān)鍵基因,但是基因與環(huán)境存在互作使鑒定過(guò)程非常復(fù)雜,至今尚無(wú)通過(guò)改變單個(gè)基因大幅提高含油量的報(bào)導(dǎo)。本論文的研究目的在于:利用擬南

2、芥與油菜的比較基因組學(xué),開(kāi)發(fā)一系列油菜油脂功能基因分子標(biāo)記；在DH系的分子標(biāo)記連鎖遺傳圖譜上進(jìn)行含油量的基因定位并鑒定關(guān)鍵候選基因；以響應(yīng)高溫的含油量近等基因系為材料,探討環(huán)境因子與QTL互作的分子機(jī)制。主要研究結(jié)果如下:
　　 1.油菜油脂功能基因分子標(biāo)記的開(kāi)發(fā):根據(jù)擬南芥油脂基因數(shù)據(jù)庫(kù)(hattp:／／lipids.plantbiology.msu.edu)中通過(guò)對(duì)擬南芥全基因組序列上與油脂相關(guān)基因的序列預(yù)測(cè),并結(jié)合每個(gè)基因

3、在各個(gè)器官中的表達(dá)序列標(biāo)簽(EST)及其分布的統(tǒng)計(jì)分析,從中選出75個(gè)在種子中高表達(dá)的基因通過(guò)與油菜數(shù)據(jù)庫(kù)的搜索比對(duì),利用油菜中的同源EST來(lái)設(shè)計(jì)引物,分析有關(guān)基因在油菜品種Tapidor和Ningyou7之間的等位多態(tài)性,共在75個(gè)基因上設(shè)計(jì)了150對(duì)引物,平均每個(gè)基因包含兩對(duì)引物。篩選標(biāo)記發(fā)現(xiàn),共51對(duì)引物具有多態(tài)性,多態(tài)性比率超過(guò)30％.
　　 2.含油量QTL的定位分析:在甘藍(lán)型油菜DH系中,將開(kāi)發(fā)的分子標(biāo)記連鎖到華中農(nóng)

4、業(yè)大學(xué)已有的TN-DH圖譜上并進(jìn)行QTL掃描,結(jié)果連鎖到遺傳圖譜上的標(biāo)記共15個(gè)；共檢測(cè)到5個(gè)標(biāo)記在含油量QTt,區(qū)間峰內(nèi),分別位于第1、3、10、11以及12連鎖群上,因此我們推測(cè)這5個(gè)候選基因可能在油菜種中油脂合成過(guò)程中扮演著非常重要的角色。生物信息學(xué)分析表明,這5個(gè)候選基因的功能均與油脂代謝相關(guān)。
　　 3.含油量QTL區(qū)間內(nèi)關(guān)鍵候選基因的鑒定:為了進(jìn)一步驗(yàn)證QTL置信區(qū)間內(nèi)的候選基因的功能,我們利用其擬南芥同源基因的相關(guān)

5、位點(diǎn)的T-DNA插入突變體,測(cè)定突變體成熟種子的含油量及脂肪酸組分,并與野生型進(jìn)行比較分析,結(jié)果5個(gè)關(guān)鍵基因位置上的等位突變體中,有3個(gè)基因位點(diǎn)上的等位變化導(dǎo)致總含油量發(fā)生了顯著變化,T-DNA插入導(dǎo)致突變體含油量變低；2個(gè)基因位點(diǎn)上的等位變化沒(méi)有導(dǎo)致總含油量的顯著變化,但卻導(dǎo)致了亞麻酸和油酸的含量發(fā)生了顯著變化,因此這些標(biāo)記可以用于分子標(biāo)記輔助育種選擇。
　　 4.溫度對(duì)油菜近等基因系含油量和脂肪酸組分的影響:油菜近等基因系總

6、含油量隨著成熟期溫度的升高而降低,亞油酸(C18:2)、亞麻酸(C18:3)以及芥酸(C22:1)含量也隨著溫度的升高而降低.在T1、T2、T3三種溫度下,NIL-9的總含油量均高于NIL-1,但是差異度并不一致,最大的差異是在高溫T3條件下,低溫T1次之,差異最小的在中溫T2條件下。
　　 5.利用基因芯片研究了溫度對(duì)近等基因系種子發(fā)育過(guò)程中基因表達(dá)的影響,結(jié)果表明:基因型、溫度以及基因型與溫度的互作在基因組水平分別引起498

7、2個(gè)、19111個(gè)、839個(gè)轉(zhuǎn)錄本的差異表達(dá).兩個(gè)近等基因系在T2條件下差異表達(dá)基因數(shù)目最少,基因組水平有251個(gè),位于qOC.C2.2 QTL區(qū)間的有39個(gè)；2個(gè)近等基因系在T1條件下的差異表達(dá)基因數(shù)目,全基因組水平有2933個(gè),位于qOC.C2.2 QTL區(qū)間的有460個(gè)；2個(gè)近等基因系在T3條件下差異表達(dá)基因數(shù)目最多,全基因組水平有3499個(gè),qOC.C2.2 QTL區(qū)間有558個(gè).這一研究結(jié)果與含油量的表型差異是一致的。

8、　　 6.目標(biāo)QTL qOC.C2.2區(qū)間內(nèi)的差異表達(dá)基因功能分類:定位于QTL區(qū)間內(nèi)的基因型差異表達(dá)基因可以被分成很多的大類,包括:調(diào)控胚發(fā)育、DNA的轉(zhuǎn)錄調(diào)控、生物非生物逆境響應(yīng)(例如:氧化還原反應(yīng)；植物鹽脅迫生理；熱激反應(yīng)；植物受傷反應(yīng)；鎘脅迫反應(yīng))、光合作用相關(guān)(例如:光呼吸；光合系統(tǒng)化學(xué)調(diào)節(jié)；糖酵解作用；蘋果酸代謝)等生理過(guò)程的基因家族。除此之外,還有一些差異表達(dá)基因的功能與蛋白質(zhì)代謝相關(guān),例如蛋白質(zhì)的合成、蛋白質(zhì)折疊以及蛋

9、白質(zhì)的胞間運(yùn)輸、轉(zhuǎn)錄起始、茉莉酸刺激響應(yīng)等。
　　 7.溫度影響QTL區(qū)間內(nèi)的差異表達(dá)基因功能分類:種子成熟期溫度降至T1或者增至T3均可引起一系列基因的上調(diào),這些基因涉及:DNA的轉(zhuǎn)錄調(diào)控、胚發(fā)育、生物非生物逆境響應(yīng)(例如:抑菌反應(yīng)；鎘脅迫反應(yīng))、蛋白質(zhì)的合成、氨基酸磷酸化、蛋白質(zhì)折疊等.與T2條件相比,T3上調(diào)了一系列基因的表達(dá),這些基因的功能涉及:熱激反應(yīng)以及泛素依賴的蛋白質(zhì)降解過(guò)程,但是下調(diào)了控制脂肪酸的合成、響應(yīng)紅光信

10、號(hào)、光合作用,赤霉素刺激響應(yīng)以及轉(zhuǎn)錄延伸的有關(guān)基因。與T2條件相比,T1上調(diào)了一系列基因的表達(dá),這些基因的功能包括:糖酵解、蘋果酸代謝、脫落酸刺激響應(yīng)、三羧酸循環(huán)以及脫水應(yīng)激反應(yīng).
　　 8.不同溫度條件下油脂合成關(guān)鍵基因的表達(dá)模式:NIL-1和NIL-9之間的遺傳差異對(duì)含油量合成相關(guān)基因BnLACS1,BnOLEO1,BnCLO1,BnFatA以及BnLHY顯著影響。與NIL-1相比,NIL-9的BnLACS1,BnCLO1,