水稻glup-t基因的精細(xì)定位及Lgcl基因分子標(biāo)記的開發(fā).pdf

1、水稻種子在胚乳中積累了大量的貯藏蛋白,其中以谷蛋白的含量居多,約占總蛋白的80％,且易于被人體消化吸收,是人類重要的蛋白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)來(lái)源。任何對(duì)谷蛋白含量和組成的改變均會(huì)引起稻米品質(zhì)的變化,開展谷蛋白相關(guān)的研究具有著重要的意義。水稻谷蛋白首先在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)表面以57 kD前體的形式合成,再轉(zhuǎn)運(yùn)至蛋白貯藏液泡中,最終大量的前體裂解為成熟的37-39 kD酸性亞基和22-23 kD堿性亞基。任一谷蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)途徑的缺陷都有可能導(dǎo)致谷蛋白前體的大量積累,形成

2、高含量的57 kD谷蛋白突變體,即57H(high amount of57 kD)突變體,因此,該類型的突變體是研究谷蛋白調(diào)控機(jī)制的重要材料。通過種質(zhì)資源的篩選我們獲得了一份57H自然突變體細(xì)老鼠牙,本論文對(duì)其研究情況進(jìn)行了報(bào)道。此外,還對(duì)低谷蛋白含量Lgc1基因設(shè)計(jì)了用于分子輔助選擇的標(biāo)記。主要研究結(jié)果如下:
　　 1.種子總蛋白的SDS-PAGE電泳圖譜表明,與野生型水稻品種相比,突變體細(xì)老鼠牙積累了大量的57 kD谷蛋白前

3、體,而成熟的酸性亞基和堿性亞基明顯減少。另外,細(xì)老鼠牙的13 kD醇溶蛋白也大幅度增加。
　　 2.將細(xì)老鼠牙分別與廣親和的粳稻品種02428和常規(guī)粳稻品種武運(yùn)粳7號(hào)進(jìn)行正反交,F1種子總蛋白表現(xiàn)為野生型,4個(gè)F2群體中中野生型與突變型呈3:1的分離比例。以上結(jié)果表明,突變體細(xì)老鼠牙的57H突變性狀受一對(duì)隱性基因控制,暫命名為glup-t基因。
　　 3.以細(xì)老鼠牙/02428的F2植株作為定位群體。通過F2種子總蛋白的

4、SDS-PAGE電泳篩選隱性單株組成定位群體。隨機(jī)選取92個(gè)隱性單株,應(yīng)用SSR標(biāo)記,將細(xì)老鼠牙的57H突變基因glup-t初步定位于第4染色體長(zhǎng)臂上的SSR標(biāo)記RM3735和RM5714之間,遺傳距離分別為2.22 cM和2.81 cM。
　　 4.為了進(jìn)一步精細(xì)定位突變基因,先后開發(fā)了新的SSR、Indel及CAPS標(biāo)記,并將定位群體放大到388個(gè)隱性單株,最終將glup-t基因精細(xì)定位于第4染色體長(zhǎng)臂的BAC克隆OSJNB

5、a0091D06上的Indel4—7、Indel4-8和CAPS4-3之間,標(biāo)記與目標(biāo)基因的遺傳距離均為0.26 cM,覆蓋約115 kb的物理距離。候選基因序列對(duì)比發(fā)現(xiàn),glup-t基因可能與glup-3/osvpe1等位；測(cè)序表明,均是發(fā)生了單核苷酸的突變,但glup-t的突變位點(diǎn)與它們的不同。在glup-t中,突變位置為第275位的絲氨酸變?yōu)樘扉T冬酰胺?？梢?glup-t是glup-3/osvpe1的一個(gè)新等位基因。根據(jù)突變體gl

6、up-t與野生型存在的單核苷酸差異,設(shè)計(jì)了由三個(gè)引物組成的PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系,經(jīng)檢測(cè)可區(qū)分出突變型、野生型及雜合型,可將其用于glup-t基因的分子標(biāo)記輔助選擇。
　　 5.低谷蛋白稻米是腎臟病人較有效的食療輔助品,培育低谷蛋白功能性水稻品種具有重大的意義。低谷蛋白含量Lgc1基因作為培育低谷蛋白功能性水稻品種的優(yōu)質(zhì)資源,受到了育種家的青睞。為提高Lgc1基因分子標(biāo)記輔助選擇的準(zhǔn)確性,我們根據(jù)其突變體在兩個(gè)谷蛋白基因GluB-4

7、和GluB-5間的堿基缺失,設(shè)計(jì)出了Lgc1的2個(gè)插入缺失標(biāo)記Indel-Lgc1-A和Indel-Lgc1-B。利用Indel標(biāo)記對(duì)W3660(Lgc1低谷蛋白品種)/南粳46(谷蛋白正常品種)的F2分離群體和其他12份谷蛋白正常水稻品種進(jìn)行檢測(cè)驗(yàn)證。依據(jù)其PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳帶型,可準(zhǔn)確地區(qū)分出低谷蛋白純合基因型、谷蛋白正常純合基因型和雜合基因型3種帶型,且3種帶型與其植株或品種相應(yīng)的蛋白性狀表現(xiàn)完全一致,表明這兩個(gè)Indel標(biāo)記可