Bacillus cereus X5的殺線活性及其生物有機(jī)肥對南方根結(jié)線蟲的防治作用研究.pdf

1、根結(jié)線蟲是嚴(yán)重危害植物的土傳病害之一，其侵染根系后形成大量的根結(jié)，而且植株表現(xiàn)生長矮小和葉片黃化等現(xiàn)象，導(dǎo)致植物對水分和養(yǎng)分的吸收困難，嚴(yán)重影響植物的正常生長和發(fā)育。因此，根結(jié)線蟲對作物造成了巨大產(chǎn)量和經(jīng)濟(jì)的損失。作物連作是引起植物根結(jié)線蟲病害發(fā)生的主要因素，但由于根結(jié)線蟲寄主范圍很廣泛，其中包括絕大多數(shù)作物和雜草，一旦發(fā)生就很難通過輪作等其他途徑防治。目前，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中防治根結(jié)線蟲的方法主要是化學(xué)防治，但是對環(huán)境和人類自身造成了許多負(fù)

2、面的影響，而且許多國家或地區(qū)已經(jīng)對防治根結(jié)線蟲的化學(xué)藥品進(jìn)入市場進(jìn)行了嚴(yán)格限制。因此，尋找新的、環(huán)境友好型的生物防治方法是非常迫切和必要的。本文的主要研究內(nèi)容和取得的試驗(yàn)結(jié)果如下:
　　 (1)根結(jié)線蟲的富集、分離、純化和鑒定試驗(yàn)。在溫室中將易感染根結(jié)線蟲的番茄品種種植在從田間采集的、且嚴(yán)重發(fā)生根結(jié)線蟲病害的土壤中進(jìn)行根結(jié)線蟲的富集。結(jié)合貝爾曼漏斗法、濕篩法和植物組織搗碎法三種方法，從番茄根系中分離根結(jié)線蟲;然后再次回接到健康土

3、壤上生長的番茄根際以進(jìn)一步純化根結(jié)線蟲;再從形態(tài)學(xué)上初步鑒定線蟲的種類。通過根結(jié)線蟲的富集和回接試驗(yàn)結(jié)果表明:與種植番茄之前的土壤相比，土壤中線蟲的數(shù)量比原來增加了1.6-3.3倍;番茄根系的根結(jié)數(shù)量劇增，根結(jié)指數(shù)到達(dá)4級，而健康土壤中生長的番茄根系發(fā)達(dá)，植株生長健康且無根結(jié)現(xiàn)象。從番茄根系中分離根結(jié)線蟲的雌線蟲、二齡幼蟲及其蟲卵，從形態(tài)學(xué)角度初步鑒定為南方根結(jié)線蟲(Meloidogyne incognita)。通過對根結(jié)線蟲的大量富集

4、、成功純化和種類鑒定，了解了根結(jié)線蟲對植物的危害程度，為以后的相關(guān)研究提供了寶貴的試驗(yàn)材料。為了進(jìn)一步了解和認(rèn)識根結(jié)線蟲的胚胎發(fā)育過程，從番茄根系直接分離的蟲卵和二齡幼蟲并進(jìn)行離體培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)和顯微觀察。試驗(yàn)結(jié)果表明:在恒溫25℃培養(yǎng)14天，觀察到根結(jié)線蟲蟲卵胚胎發(fā)育階段有:單胞期、雙胞期、三胞期、四胞期、囊胚期、原腸期、一齡幼蟲階段、二齡幼蟲第一次脫皮、二齡幼蟲第二次脫皮和具有侵染能力的二齡幼蟲。
　　 (2)生防菌的篩選試驗(yàn)。根

5、據(jù)根結(jié)線蟲體壁的主要成分是膠原蛋白構(gòu)成這一特征出發(fā)，篩選能分泌膠原蛋白酶的目標(biāo)菌株。首先采用稀釋平板涂布方法從番茄根際土壤中初步篩選出具水解膠原蛋白作用的菌株，其次通過各菌株發(fā)酵上清液對根結(jié)線蟲二齡幼蟲的死亡率和蟲卵孵化率抑制作用，再以拮抗菌懸浮液處理番茄根系，觀察其對根結(jié)線蟲侵染番茄根系的影響。通過以上試驗(yàn)篩選出了高效根際細(xì)菌菌株和認(rèn)識菌株與根結(jié)線蟲的作用模式。本實(shí)驗(yàn)篩選出了10株有較強(qiáng)水解膠原蛋白的細(xì)菌，其中菌株X5和BTG具有很強(qiáng)

6、的明膠水解能力，二者的膠原酶活分別為40.5 U·mL-1和37.3U·mL-1。將菌株X5和BTG發(fā)酵上清液處理二齡幼蟲24 h后的死亡率比對照（無菌上清液）處理的死亡率分別提高了73.1％和60.2％;菌株X5和BTG上清液處理14天后的蟲卵孵化率比對照的孵化率分別降低了37.7％和25.6％。將菌株X5和BTG的培養(yǎng)液分別稀釋成三種不同的濃度（分別為1、1/2和1/4發(fā)酵原液）進(jìn)行培養(yǎng)，結(jié)果表明:隨著濃度的降低，蟲卵孵化率升高和二

7、齡幼蟲死亡率減低。菌株X5和BTG的菌懸液處理后的番茄根結(jié)數(shù)比對照（不加菌懸液）根結(jié)數(shù)分別降低了79.5％和64.8％。通過16SrDNA序列分析表明，菌株X5和BTG分別屬于蠟狀芽孢桿菌(Bacillus cereus)和蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis)。通過比較各株細(xì)菌對二齡幼蟲(J2)死亡率、蟲卵孵化率及番茄根結(jié)數(shù)量的影響，菌株X5對根結(jié)線蟲的防治效果優(yōu)于菌株BTG。顯微觀察發(fā)現(xiàn)，菌株X5處理過的大部

8、分蟲卵內(nèi)部結(jié)構(gòu)受到破壞或者發(fā)生紊亂，而且蟲卵液泡化程度較高。說明菌株X5不僅對根結(jié)線蟲的二齡幼蟲有致死的效果，同時對蟲卵的孵化有較強(qiáng)的抑制作用。因此，選擇菌株X5作為本研究的目標(biāo)菌株。
　　 (3)膠原蛋白酶的特征與殺線活性。通過硫酸銨沉淀、凝膠層析和陽離子交換層析從菌株X5發(fā)酵液中分離純化得到較純的膠原蛋白酶。該酶表現(xiàn)出較強(qiáng)的水解膠原蛋白的效果，純化后比活力由13.0 U·mg-1提高至153.4 U·mg-1，提純倍數(shù)達(dá)11

9、.8倍，發(fā)酵液中酶的回收率為9.3％。該酶的純化產(chǎn)物在SDS-PAGE上得到單一條帶，蛋白酶分子量約為45 kDa左右。該酶對根結(jié)線蟲有很強(qiáng)致死作用，二齡幼蟲死亡率達(dá)到80％，蟲卵孵化率降低到23.9％。同時，通過電鏡掃描觀察到該酶液能夠破壞幼蟲的表皮，蟲卵表皮也受到破壞并且內(nèi)部結(jié)構(gòu)物質(zhì)發(fā)生了紊亂現(xiàn)象。膠原蛋白酶酶學(xué)性質(zhì)研究表明，該酶最適作用溫度為35℃;在10℃-45℃范圍內(nèi)具有較好的熱穩(wěn)定性;最適合作用pH值為8.0，并且在pH7.

10、0-10.0范圍內(nèi)膠原蛋白酶活性比較穩(wěn)定。Mg2+、Zn2+、Fe2+和Ca2+對蛋白酶具有較強(qiáng)的激活作用，其中以Ca2+激活作用最大;而Cu2+、Ba2+、Fe3+和Mn2+對膠原蛋白活性有一定的抑制作用。苯甲基磺酰氟(PMSF)能夠強(qiáng)烈抑制蛋白酶的活性，說明該蛋白酶屬于絲氨酸蛋白酶家族。而乙二胺四乙酸(EDTA)對膠原蛋白酶的抑制作用很小。因此，從菌株X5發(fā)酵液中分離純化出的膠原蛋白酶對根結(jié)線蟲致死作用與分解線蟲外表皮和降低蟲卵孵化

11、能力有關(guān)。
　　 (4)菌株X5在土壤和番茄根系上的定殖能力。通過電轉(zhuǎn)化引入綠色熒光標(biāo)記質(zhì)粒pHAPⅡ得到穩(wěn)定表達(dá)較強(qiáng)的熒光標(biāo)記菌株X5-gfp，并利用冷凍切片方法和熒光顯微鏡，分別觀察標(biāo)記菌株在土壤中和番茄根系上的定殖情況，在室內(nèi)離體培養(yǎng)條件下，檢測其對二齡幼蟲和蟲卵孵化的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:菌株X5-gfp的質(zhì)粒轉(zhuǎn)接到20代和25代時粒穩(wěn)定性分別為76.2％和60.5％，說明重組質(zhì)粒在出發(fā)菌株體內(nèi)可以較穩(wěn)定的遺傳。在同樣的生

12、長條件下，菌株X5-gfp的生長規(guī)律和形態(tài)特征都未發(fā)生改變，與出發(fā)菌株X5基本一致，說明其生長規(guī)律和形態(tài)特征沒有受到外源質(zhì)粒的影響。標(biāo)記菌株對二齡幼蟲的致死率為66.3％，二齡幼蟲孵化抑制率為65.1％。觀察到標(biāo)記菌株在土體土、根際土和根表都有大量定殖，其數(shù)量分布趨勢是根際＞根表＞土體。土體土中菌株X5-gfp數(shù)量在第7天達(dá)到6.6×108 cfu·g-1。經(jīng)過35天后，基于標(biāo)記菌株X5-gfp的生物有機(jī)肥的處理明顯減少番茄根系的根結(jié)數(shù)

13、量，比對照處理的根結(jié)數(shù)量減少了63.1％。因此，通過GFP標(biāo)記菌株證明菌株X5能夠在番茄根系上和土壤中定殖，從而抑制或減輕了根結(jié)線蟲對番茄根系危害。
　　 (5)由菌株X5和BTG發(fā)酵而成的生物有機(jī)肥料對番茄根結(jié)線蟲的防治效果。通過溫室盆栽試驗(yàn)，研究了施用生物有機(jī)肥60天后番茄植株生長、卵塊和蟲卵數(shù)量和根際土壤中根結(jié)線蟲數(shù)量變化的影響。結(jié)果表明，與對照（未接種任何菌株的常規(guī)有機(jī)肥）相比，BIO、X5和BTG三種生物有機(jī)肥各自單一

14、處理和二者復(fù)合(X5+BTG)處理施用后，地上部分和根系干重分別增加了0.5-0.9倍和0.7-0.9倍。每株卵塊數(shù)和每卵塊的蟲卵數(shù)分別減少了24.4％-54.2％和21.8％-54.3％;根際土壤中根結(jié)線蟲數(shù)量減少了18.6％-49.2％。三種生物有機(jī)肥復(fù)合(BIO+X5+BTG)施用，地上部分和根系干重分別增加了2.1倍和1.5倍;每株卵塊數(shù)量和每卵塊蟲卵數(shù)量分別減少了67.2％和62.1％;根際土壤中線蟲數(shù)量減少了50.7％。田間

15、試驗(yàn)表明，單獨(dú)施用菌株X5發(fā)酵的生物有機(jī)肥處理(X5)或施用混合微生物有機(jī)肥處理(BIO+X5+BTG)都能有效防治根結(jié)線蟲，甜瓜根結(jié)指數(shù)分別比對照處理降低了77.6％和81.6％。溫室和田間試驗(yàn)結(jié)果表明，施用功能菌生物有機(jī)肥有效減輕了根結(jié)線蟲對番茄和甜瓜的危害;促進(jìn)了番茄和甜瓜植株的生長，菌株X5在相關(guān)生物有機(jī)肥防治根結(jié)線蟲中也可以起到的增效作用。
　　 (6)防治根結(jié)線蟲病害的綜合管理措施。在溫室條件下，采用覆膜陽光消毒、有

16、機(jī)物料生物熏蒸和接種菌株X5的方法對根結(jié)線蟲的防治作用進(jìn)行了研究，測定了番茄生物量、根結(jié)線蟲侵染以及根際土壤和土體土壤中微生物數(shù)量的變化。結(jié)果表明，對線蟲滋生土壤進(jìn)行覆膜陽光消毒、生物熏蒸和接種拮抗菌的聯(lián)合處理的效果最佳，優(yōu)于單一處理。聯(lián)合處理的總生物干重比對照（未進(jìn)行任何處理）增加了1.8倍，每株卵塊數(shù)和每卵塊的蟲卵數(shù)量減少了2倍和3.7倍，對根結(jié)線蟲的防治效果達(dá)到82.7％，根際土壤和土體土壤的細(xì)菌和真菌數(shù)量顯著增加，土壤中線蟲的數(shù)