Studies on the Citrus Tristeza Virus and Citrus Viroids in Pakistan.pdf

1、柑橘衰退病毒(Citrus tristeza virus,CTV)廣泛分布于全世界各柑橘產(chǎn)區(qū),由該病毒引起的柑橘衰退病是柑橘產(chǎn)業(yè)中最具毀滅性的病害之一。CTV屬于長線形病毒科長線形病毒屬的正義單鏈RNA病毒,主要存在于寄主韌皮部,可通過蚜蟲以半持久方式進(jìn)行短距離傳播,或通過感病苗木調(diào)運(yùn)進(jìn)行遠(yuǎn)距離傳播。CTV病毒粒子是彎曲的線狀病毒,大小約為11nm×2,000nm,基因組大小約為19,300nt,是迄今已知侵染植物的最大RNA病毒。其基

2、因組RNA中包含12個開放閱讀框(Open reading frames,ORFs),大約可編碼19種蛋白,在5’和3’末端各存在一段長度為107nt和275nt的非編碼區(qū)(Untranslated regions,UTRs)。現(xiàn)己發(fā)現(xiàn)CTV株系或分離株有復(fù)雜的多樣性,這些多樣性造成了柑橘產(chǎn)生一系列的癥狀,如酸橙砧柑橘上的速衰、甜橙和葡萄柚等品種上的莖陷點(diǎn)和檸檬等品種上的苗黃等。莖陷點(diǎn)型衰退病已對許多柑橘易感品種構(gòu)成了嚴(yán)重的威脅,如巴基

3、斯坦潘潔普的甜橙、葡萄柚。經(jīng)驗(yàn)表明,在一些強(qiáng)毒株系和褐色橘蚜共存的國家,弱毒株系交叉保護(hù)(Mild strain cross protection,MSCP)是預(yù)防柑橘品種免受莖陷點(diǎn)型CTV為害的最有效的方法。運(yùn)用MSCP的前提是進(jìn)行病害普查,并從中鑒定篩選有應(yīng)用潛力的弱毒株系。
　　 本研究從巴基斯坦的潘潔普市的五個地區(qū)—Sargodha、Bhalwal、Sahiwal、Faisalabad和Toba Tek Singh分別采

4、集柑橘樣品,運(yùn)用直接組織點(diǎn)免疫法(Directtissue blot immuno-assay,DTBIA)和反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)技術(shù)初步篩選感染CTV的樣品,然后將毒源嫁接接種于甜橙上,并保存于溫室。通過對巴基斯坦CTV分離株主要外殼蛋白基因p25進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增,然后利用限制性片段長度多態(tài)性(Restriction

5、fragmentlength polymorphism,RFLP)和單鏈構(gòu)象多態(tài)性(Single strand conformationpolymorphism,SSCP)技術(shù)分析其p25/HinfⅠRFLP所屬組群及其分子特征。隨后,利用RT-PCR分別擴(kuò)增從不同品種上收集到的21個分離株的4個基因(p23、p20、p18和p25)并進(jìn)行測序,利用BioEdit和MEGA軟件,對所采集樣品與GenBank數(shù)據(jù)庫中的國外代表性分離株的部

6、分序列進(jìn)行序列比對和系統(tǒng)進(jìn)化發(fā)育分析,推斷其遺傳多樣性和親緣關(guān)系,從而為防治柑橘衰退病的弱毒株系交叉保護(hù)技術(shù)提供基礎(chǔ)性數(shù)據(jù)支持。同時,本論文作者與另一博士生曹孟籍積極合作,還采用一步法RT-PCR.技術(shù)對樣品中的柑橘類病毒一柑橘裂皮類病毒(Citrus exocortis viroid,CEVd),柑橘曲葉類病毒(Citrus bent leaf viroid CBLNd),啤酒花矮化類病毒(Hop stunt viroid HSVd)

7、,柑橘矮化類病毒(Citrus dwarfing viroi,CDVd),柑橘樹皮爆裂類病毒(Citrus bark cracking viroid CBCVd)進(jìn)行了檢測。
　　 主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果
　　 1 CTV樣品的收集和檢測
　　 2008年從巴基斯坦的Punjab市的五個地區(qū)共采集樣品280份,運(yùn)用DTBIA和RT-PCR方法共檢測出85份樣品感染了CTV。次年從巴基斯坦Punjab市的五個地區(qū)(Sargo

8、dha,Bhalwal,Sahiwal,Faisalabad and Toba Tek Singh)共采集樣品260份,通過DTBIA和RT-PCR檢測后,其中104份樣品感染了CTV。
　　 2 CTV分離株RFLP和SSCP分析
　　 2.12008年和2009年所采樣品的RFLP分析
　　 巴基斯坦的CTV分離株主要以p25/HinfⅠRFLP第3組群為主,其次為第1組群,感染率(單一組群和混合組群)分別為

9、78.57％和28.57％,且未發(fā)現(xiàn)p25/HinfⅠRFIP第7組群。
　　 通過檢測所采得樣品,CTV的混合組群率和單一組群率分別為35.6％和64.2％;在椏柑中的混合組群率為57％,單一組群率為43％;在甜橙中的混合組群率和單一組群率分別為35.7％和64.28％。
　　 2.22008和2009年所采樣品的SSCP分析
　　 對所有單一毒源分離株及各分離株CTV的部分基因的不同克隆進(jìn)行了SSCP分析,結(jié)

10、果表明,大部分分離株均是在一個相同的主序列上產(chǎn)生的變化。
　　 3序列比對和遺傳變異分析
　　 3.1序列比對分析
　　 實(shí)驗(yàn)所用到的21個CTV分離株,10個來自甜橙,1個來自甜株檬,10個來自椏柑。對這21個不同CTV分離株的4個基因(p23、p20、p18、p25)進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增并克隆測序。通過分析其核酸序列及其氨基酸序列的一致性,結(jié)果表明,21個分離株序列間的相似性在93.1％～100％(核苷酸序列

11、)和89.8％～100％(氨基酸序列)。這些CTV分離株與CTV參考株系之間的相似性分別為69.6％-99.4％(核苷酸序列)和88.6％～98.2％(氨基酸序列)。值得說明的是,由于部分樣品某些基因的克隆測序未獲成功,因此實(shí)驗(yàn)中所測得的不同基因的序列并非均分別來自相同的樣品。這些結(jié)果表明,在巴基斯坦潘潔普的CTV分離株序列一致性較為保守,但與其他國家(全部或部分)CTV分離株相比差異較大。序列相似性分析結(jié)果與先前報道的不同CTV株系的

12、p25基因分析結(jié)果相似。
　　 3.2系統(tǒng)進(jìn)化分析
　　 通過鄰接法(Neighbor-joining method,NJ)推導(dǎo)出了每個基因核苷酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹。使用相同方法,從氨基酸序列推導(dǎo)的系統(tǒng)進(jìn)化樹與從核苷酸序列推導(dǎo)的系統(tǒng)進(jìn)化樹相比,顯示了相同的分組結(jié)果。此外,從氨基酸序列推導(dǎo)的系統(tǒng)進(jìn)化樹也得到了相同的結(jié)果。序列中核苷酸的變異程度決定了系統(tǒng)進(jìn)化樹各分支的長度。盡管存在寄主多樣性和地理差異,但從巴基斯坦潘潔普得到的

13、大多數(shù)CTV分離株都?xì)w到一個組群里。這些株系通過p18和p25基因建立的系統(tǒng)進(jìn)化樹顯示較多的組群,而用p20和p23基因建立的系統(tǒng)進(jìn)化樹這些株系又被歸到了一個組群。除分離株109、188和215外,用p20基因建立的系統(tǒng)進(jìn)化樹表明大多數(shù)的株系都被歸到一個組群。分離株109距日本的NuagA(苗黃分離株)和加利福尼亞的SY568(速衰型和莖陷點(diǎn)型分離株)較近,分離株188和215距以色列的VT(速衰型和葡萄柚的莖陷點(diǎn)型分離株)較近。然而,

14、用p23基因建立系統(tǒng)進(jìn)化樹表明,來自巴基斯坦潘潔普的分離株180、231、215,與報道過的其他國家株系VT、B165、SY568和NuagA相距很近。來自巴基斯坦潘潔普無癥甜檸檬的分離株157,離其它所有組群和亞組最遠(yuǎn)。用p18和p25基因建立的系統(tǒng)進(jìn)化樹顯示了更多的組群。用p18基因建立的系統(tǒng)進(jìn)化樹顯示,來自巴基斯坦潘潔普的分離株242和來自中國的CT-9(弱毒分離物)很相近。并且,分離株109和180與T36和墨西哥-ctv(兩種

15、都是速衰型分離株)很相近。用p25基因建立的系統(tǒng)進(jìn)化樹發(fā)現(xiàn),來自巴基斯潘潔普的分離株142和其它組群相距甚遠(yuǎn),顯示了很大差異。然而,分離株146又和來自以色列的VT相距很近。分離株T30、T385、T36和墨西哥-ctv緊密相關(guān)。同時,CT-9、NuagA、SY568分別和B165緊密相關(guān)。
　　 3.3氨基酸序列的矩陣分析
　　 對157分離株的p23基因進(jìn)行了矩陣分析,結(jié)果顯示,157分離株與中國的CT-9、西班牙的

16、T385和美國佛羅里達(dá)的T30等弱毒株具有較大的相似性。P23基因中一些特異位點(diǎn)的多態(tài)性,將有助于我們區(qū)別弱毒株系和強(qiáng)毒株系。
　　 4生物學(xué)鑒定
　　 對11株來自巴基斯坦潘潔普地區(qū)的CTV分離株進(jìn)行了生物學(xué)鑒定。使用六種指示植物:墨西哥萊蒙、鄧肯葡萄柚/酸橙砧、鳳凰柚/普通柚砧、西蒙斯甜橙/酸橙砧、西蒙斯實(shí)生苗和酸橙實(shí)生苗。11個CTV分離株中的Lo個在墨西哥萊蒙上表現(xiàn)出輕度至較嚴(yán)重的脈明和莖陷點(diǎn)癥狀。2個CTV分離

17、株在鄧肯葡萄柚和酸橙實(shí)生苗上表現(xiàn)出輕微和中度苗黃癥狀。各分離株在酸橙和鳳凰柚上無明顯的其它癥狀。兩種分離株在西蒙斯甜橙上表現(xiàn)出莖陷點(diǎn)癥狀。結(jié)果顯示:本實(shí)驗(yàn)中用到的CTV分離株可能多屬于弱毒或中毒,一些株系有望用于弱毒株系交叉保護(hù)。
　　 5巴基斯坦潘潔普地區(qū)柑橘類病毒的初步鑒定
　　 于2008年采自于巴基斯坦潘潔普地區(qū)的樣品中檢測到類病毒。使用多重RT-PCR同時檢測CEVd、CBLVd、HSVd、CDVd和CBCVd

18、,擴(kuò)增并克隆測序,測序結(jié)果在GenBank上進(jìn)行BLAST比對,結(jié)果顯示,分別有12、8、3l和17份樣品中帶有CEVd、CBLVd、HSVd和CDVd。所有采到的樣品中未檢測到CBCVd的存在。
　　 結(jié)論
　　 本研究中檢測了采自巴基斯坦潘潔普柑橘種植區(qū)的柑橘樣品,檢測出該地區(qū)有柑橘衰退病和類病毒發(fā)生,并對不同CTV株系的p25基因進(jìn)行SSCP和RFLP分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn),大部分陽性樣品僅感染了CTV的單一株系,用Hin

19、fⅠ限制性內(nèi)切酶對其p25基因酶切進(jìn)行RFLP分析,發(fā)現(xiàn)所采集的樣品中CTV主要為第1組群和第3組群。
　　 運(yùn)用RT-PCR擴(kuò)增CTV的4個基因,克隆測序后,分別對其核苷酸序列及其氨基酸序列進(jìn)行相似性分析、遺傳進(jìn)化與系統(tǒng)發(fā)育分析。通過比對分析發(fā)現(xiàn),采集的所有CTV分離株均聚為單獨(dú)的一類,且具有高度的同源性,同時來自不同地區(qū)的樣品又存在一定的差異,具有相同生物學(xué)特性的株系往往聚為一類,表明巴基斯坦CTV分離株間存在較為復(fù)雜的遺傳