塔羅科血橙新系(Citrus sinensis Osbeck)有性生殖過程及無核機(jī)理探討.pdf

1、有性生殖是植物生活史中最關(guān)鍵的環(huán)節(jié),也是人們一直關(guān)注的研究熱點。其研究涉及較多的學(xué)科領(lǐng)域,主要包含授粉、受精、胚胎發(fā)育等一系列重要事件。塔羅科血橙新系是由中國農(nóng)科院柑橘研究所從意大利品種塔羅科血橙實生苗珠心系后代中選育出來的優(yōu)變無性系,具有無核、果大、晚熟、質(zhì)優(yōu)、抗寒等特點。目前基于該品種的相關(guān)研究報道較少,僅有少量關(guān)于栽培技術(shù)的研究,其有性生殖相關(guān)的研究尚屬空白;而偶然的研究發(fā)現(xiàn),塔羅科血橙新系人工自交能產(chǎn)生較多的種子,這與天然自交的

2、結(jié)果有極大的差異。因此,揭示其有性生殖過程、探明其無核機(jī)理,將對塔羅科血橙新系乃至柑橘生殖生物學(xué)的相關(guān)研究都有重要的科學(xué)意義,也對無核新系的生產(chǎn)實踐有重要的參考意義。本研究以塔羅科血橙新系為試材,通過雌雄配子發(fā)育、授粉受精過程及雜種后代鑒定等研究,以揭示其有性生殖過程及無核機(jī)理。其主要的研究結(jié)果如下:
　　 通過連續(xù)石蠟切片,對塔羅科血橙新系花藥的發(fā)育進(jìn)行觀察。結(jié)果表明:塔羅科血橙新系的花藥呈蝶形,具有4個花粉囊,藥室由內(nèi)到外分

3、為絨氈層(1-2層細(xì)胞)、藥室內(nèi)壁(單層細(xì)胞)和中層(2-3層細(xì)胞)3層組織構(gòu)成,囊壁外由單層的表皮層細(xì)胞包裹。在花藥發(fā)育的過程中,存在絨氈層退化延遲和退化不徹底;部分單核期小孢子無法發(fā)育到雙核期:少數(shù)小孢子超前發(fā)育成成熟花粉等異?，F(xiàn)象,這些異常現(xiàn)象影響到小孢子成熟的過程。
　　 利用改良小孢子涂片法對塔羅科血橙新系小孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂的過程進(jìn)行了觀察。結(jié)果表明:減數(shù)分裂過程中存在的大量的異常情況,雙線期和終變期存在單價體(63

4、.93%)、三價體(21.46%)和多價體(26.94%)等聯(lián)會異常;中期Ⅰ存在染色體落后(13.27%);后期I存在染色體落后(1.78%)、不均等分裂(8.28%)和染色體橋(12.72%);末Ⅰ存在不均等分裂(4.63%)和染色體落后(1.85%);中Ⅱ存在染色體落后(4.17%);四分體時期存在二分體(2.99%)和三分體(5.79%)。同時還發(fā)現(xiàn)多倍化細(xì)胞分裂的少數(shù)過程,并發(fā)現(xiàn)在多倍化的細(xì)胞中期存在聯(lián)會的異?，F(xiàn)象。在諸多異常的

5、現(xiàn)象中,聯(lián)會異常的高頻出現(xiàn),甚至無法觀察到正常聯(lián)會的9對二價體的現(xiàn)象最為突出,并且推斷染色體聯(lián)會異常是導(dǎo)致塔羅科血橙新系花粉低育性的主要原因。
　　 對小孢子的發(fā)育過程觀察表明,塔羅科血橙新系雄性配子可以完成整個發(fā)育過程形成成熟的花粉粒,并最終在花粉管中形成2個精細(xì)胞。
　　 通過掃描電子顯微鏡對塔羅科血橙新系的成熟花粉掃描觀察發(fā)現(xiàn),正常的花粉成長球形或近圓形,長圓形花粉大小約為27μm×19μm;近圓形花粉大小約為25

6、μm×23μm。具有4條萌發(fā)溝,極面觀4瓣裂圓形,見4溝和孔;赤道面觀呈長圓形或近圓形,見1～2溝和孔,溝狹長,中部可見突出的孔膜;溝長約為18μm。表面具細(xì)網(wǎng)裝紋飾,網(wǎng)眼呈圓形,較淺且大小不一;網(wǎng)脊平寬光滑。根據(jù)埃爾德曼的NPC分類系統(tǒng),塔羅科血橙新系屬于N4P4C5型。同時還發(fā)現(xiàn)存在大量的畸形花粉(48.3%),并將畸形花粉歸結(jié)為萌發(fā)溝分布異常、表面不均等塌陷、碗碟形和楊桃形4種類型。并推測這是前期發(fā)育異常所致。
　　 通過

7、去壁低滲-火焰干燥法制片確定塔羅科血橙新系體細(xì)胞為二倍體(2n=2x=18),表明其無核非倍性所致;且進(jìn)一步利用流式細(xì)胞術(shù)對其花粉相對DNA含量測定發(fā)現(xiàn),相對DNA含量與對照均呈正態(tài)分布,含量曲線基本一致,表明塔羅科血橙新系所產(chǎn)生花粉多為n配子,而其無核不全由異常雄配子造成。
　　 塔羅科血橙新系平均單個花藥的花粉含量為1.24×104粒,按照每朵花22～24個花藥計算,每朵花有2.7×105～3.0×105?；ǚ?相對較低。通

8、過I2-KI染色其活力為36.8%,而離體萌發(fā)率為0.61%,也即每朵花有萌發(fā)力的花粉僅為1664.08～1815.36,顯著低于其他有核的品種,屬于低育型的花粉。推測花粉活力低下是塔羅科血橙新系無核原因之一。
　　 通過連續(xù)石蠟切片,對塔羅科血橙新系胚囊觀察發(fā)現(xiàn),塔羅科血橙新系的子房分為10-11個心室,每室內(nèi)有4-6個胚珠分兩排縱向平行排列倒生于心室內(nèi)。成熟的胚珠呈蓼型,由株柄、珠心、胚囊和兩層珠被構(gòu)成。此外塔羅科血橙新系的

9、成熟子房中,有胚囊退化現(xiàn)象發(fā)生,推測部分雌配子的敗育也是塔羅科血橙新系無核原因之一。
　　 通過塔羅科血橙新系花藥開裂和花柱粘液的觀察,發(fā)現(xiàn)花藥在開花1天后才有部分花藥開裂釋放花粉;柱頭在開花前2天至開花當(dāng)天具有較高的可授性,而1天后就表現(xiàn)出較明顯風(fēng)干跡象,可授性降低;此外,通過花粉原位萌發(fā)試驗觀察發(fā)現(xiàn),人工授粉的柱頭上萌發(fā)的花粉量遠(yuǎn)高于天然授粉;而其人工自交和雜交后,其花粉在授粉后2d均可以完成穿柱過程。表明塔羅科血橙新系的花

10、粉育性雖然較低,但是具有完成授粉受精過程的潛力。此外,對塔羅科血橙新系自然授粉和人工授粉發(fā)現(xiàn),自然授粉的塔羅科血橙新系單個果實平均種子數(shù)為0.33粒,表現(xiàn)出了較好的無核形狀;但是在進(jìn)行人工自交或雜交授粉時,單果平均種子數(shù)為4粒以上。由此推斷,自然授粉狀況下,花藥開裂遲而柱頭粘液風(fēng)干較快使可授性降低,是影響人工授粉和天然授粉種子產(chǎn)生數(shù)量差異的原因之一,也是塔羅科血橙新系無核的重要原因。
　　 綜上所述,塔羅科血橙新系雌、雄配子在發(fā)