臍橙(Citrus sinensis Osbeck)晚熟芽變性狀形成機理研究.pdf

1、奉節(jié)晚橙(Citrus sinensis Osbeck)是一個來源奉節(jié)72-1臍橙的晚熟芽變品種。這兩個品種一起將構成一個很好的柑橘成熟機理研究體系。加強對奉節(jié)晚橙的研究,明確奉節(jié)晚橙晚熟芽變發(fā)生的機理,將為柑橘熟期育種奠定理論基礎,最終有助于柑橘產(chǎn)業(yè)的持續(xù)健康發(fā)展。本文研究了奉節(jié)晚橙與奉節(jié)72-1臍橙在果實成熟過程中的糖酸、色素、以及轉錄水平的變化,探討了晚熟芽變臍橙發(fā)生因為,取得如下主要結果:
　　 1.建立了一種適合于柑橘

2、不同時期不同組織的RNA提取方法。利用該方法所提取的RNA的A260/A280在1.65-1.90之間,A260/A230大于2.0:其質量和濃度能夠直接用于其它分子研究,如RT-PCR,cDNA-AFLP和Northern雜交(地高辛)實驗。
　　 2.著色差異分析表明:與奉節(jié)72-1臍橙著色相比,奉節(jié)晚橙的轉色期約延遲30天左右,造成這種著色延遲的因為主要是奉節(jié)晚橙果皮前期葉綠素含量減少進程和后期類胡蘿卜素積累進程推遲所致。

3、奉節(jié)晚橙果皮的葉綠素含量顯著減少發(fā)生在11月上旬到11月下旬,遲于奉節(jié)72-1品種,后者葉綠素含量顯著降低發(fā)生在10月中下旬到11月上旬；奉節(jié)晚橙果皮的類胡蘿卜素含量顯著積累始于12月中旬,而奉節(jié)72-1品種則始于11月初。另外奉節(jié)晚橙果皮中葉綠素含量在10至11月間顯著高于原品種,類胡蘿卜素含量在12至1月間顯著低于原品種。基因表達分析發(fā)現(xiàn),奉節(jié)晚橙果皮的類胡蘿卜素合成酶的相關基因較強表達的時間也整體遲于奉節(jié)72-1臍橙；葉綠素水解酶

4、基因表達在10至12月中旬其表達強度較奉節(jié)72-1臍橙弱,翌年1月份則有較強的表達。
　　 3.通過對果實成熟過程中的糖分積累分析表明,奉節(jié)晚橙和奉節(jié)72-1臍橙果實在成熟過程中兩個品種的糖分變化差異主要發(fā)生在果肉組織,且奉節(jié)晚橙果肉中三種糖分含量在12月中旬之前是顯著低于奉節(jié)72-1臍橙果肉中的糖分含量,而在元月份后則明顯高于后者；果皮中奉節(jié)晚橙的蔗糖含量在果實成熟前期兩個時期(10月11日和11月3日)顯著低于奉節(jié)72-1臍

5、橙。而蔗糖相關代謝酶基因表達分析表明,兩個品種果肉中酸性轉化酶和蔗糖合酶的基因表達表現(xiàn)明顯差異,這種差異部分影響了奉節(jié)晚橙和奉節(jié)72-1果實間的糖分差異。
　　 4.奉節(jié)晚橙和奉節(jié)72-1臍橙果肉酸積累分析發(fā)現(xiàn)奉節(jié)晚橙在成熟前期檸檬酸含量顯著高于奉節(jié)72-1臍橙,而在后期(11月底始)則低于后者；在果實成熟中期,奉節(jié)晚橙節(jié)果酸含量顯著低于對照品種。檸檬酸代謝相關酶基因表達分析表明檸檬酸合成酶和順烏頭酸酶基因表達在兩個品種間表現(xiàn)差

6、異,而造成奉節(jié)晚橙檸檬酸含量與奉節(jié)72-1的差異可能與此時奉節(jié)晚橙果肉中檸檬酸合酶基因表達較強和順烏頭酸酶基因表達受抑制相關。
　　 5.利用分子標記技術,SSR和AFLP對兩個品種的DNA差異進行分析,未發(fā)現(xiàn)兩個品種間在DNA水平上可重復的差異。
　　 6.采用cDNA-AFLP技術分析了兩個品種的果實在成熟過程中轉錄水平的表達,并對cDNA-AFLP的結果進行了進一步驗證。實驗篩選了120對選擇性引物,總共獲得近20

7、000多條清晰帶,結果發(fā)現(xiàn)其中有34對引物出現(xiàn)差異帶,檢測到144條清晰的轉錄差異帶(TDFs)。在成功回收的129個TDFs中,通過測序和序列比對(Blastx)分析表明表達差異片段主要與信號轉導、轉錄因子、成熟衰老、抗逆性、核糖體蛋白和DNA復制等有關。
　　 7.利用RACE技術,以cDNA-AFLP技術獲得的差異片段為基礎克隆了6個與成熟相關的基因,分別命名為CitPG(EF185420)、CitCAD(EF185415

8、)、CitMads(EF185417)、CitMAP(EF185418),CitNAC(EF185419)、CitEREBP(EF185416),除了MADs-box基因外,其它5個目前在柑橘中還未見報道,且CitMads與目前報道的柑橘Mads-box基因序列不同。表達分析表明在果實成熟過程中,他們在兩個品種的果皮或果肉組織中有表達差異,可能與晚熟性狀的表現(xiàn)有關。
　　 以上研究結果表明,相對奉節(jié)72-1臍橙,奉節(jié)晚橙在許多方

9、面發(fā)生了改變,這種性狀的改變很顯然不是因為某一相關指標因子發(fā)生突變而引起局部性狀發(fā)生改變,而確實是果實成熟過程或發(fā)育過程整體延遲所致。而導致這種整體改變可能是在表達水平上而非在DNA水平發(fā)生改變。由于果實成熟是一個綜合而又復雜的過程,而非躍變型柑橘果實是一個漸進式的程序性過程,因此要使奉節(jié)晚橙整體協(xié)調(diào)發(fā)生改變,那么這種改變的發(fā)生很有可能在果實發(fā)育過程或成熟過程發(fā)生的上游某個階段,即可能是啟動果實成熟開始的一個‘開關’發(fā)生變化,從而導致奉