臍橙(Citrus sinensis Osbeck)晚熟芽變性狀形成機(jī)理研究.pdf

1、奉節(jié)晚橙(Citrus sinensis Osbeck)是一個(gè)來源奉節(jié)72-1臍橙的晚熟芽變品種。這兩個(gè)品種一起將構(gòu)成一個(gè)很好的柑橘成熟機(jī)理研究體系。加強(qiáng)對(duì)奉節(jié)晚橙的研究,明確奉節(jié)晚橙晚熟芽變發(fā)生的機(jī)理,將為柑橘熟期育種奠定理論基礎(chǔ),最終有助于柑橘產(chǎn)業(yè)的持續(xù)健康發(fā)展。本文研究了奉節(jié)晚橙與奉節(jié)72-1臍橙在果實(shí)成熟過程中的糖酸、色素、以及轉(zhuǎn)錄水平的變化,探討了晚熟芽變臍橙發(fā)生因?yàn)?取得如下主要結(jié)果:
　　 1.建立了一種適合于柑橘

2、不同時(shí)期不同組織的RNA提取方法。利用該方法所提取的RNA的A260/A280在1.65-1.90之間,A260/A230大于2.0:其質(zhì)量和濃度能夠直接用于其它分子研究,如RT-PCR,cDNA-AFLP和Northern雜交(地高辛)實(shí)驗(yàn)。
　　 2.著色差異分析表明:與奉節(jié)72-1臍橙著色相比,奉節(jié)晚橙的轉(zhuǎn)色期約延遲30天左右,造成這種著色延遲的因?yàn)橹饕欠罟?jié)晚橙果皮前期葉綠素含量減少進(jìn)程和后期類胡蘿卜素積累進(jìn)程推遲所致。

3、奉節(jié)晚橙果皮的葉綠素含量顯著減少發(fā)生在11月上旬到11月下旬,遲于奉節(jié)72-1品種,后者葉綠素含量顯著降低發(fā)生在10月中下旬到11月上旬；奉節(jié)晚橙果皮的類胡蘿卜素含量顯著積累始于12月中旬,而奉節(jié)72-1品種則始于11月初。另外奉節(jié)晚橙果皮中葉綠素含量在10至11月間顯著高于原品種,類胡蘿卜素含量在12至1月間顯著低于原品種?；虮磉_(dá)分析發(fā)現(xiàn),奉節(jié)晚橙果皮的類胡蘿卜素合成酶的相關(guān)基因較強(qiáng)表達(dá)的時(shí)間也整體遲于奉節(jié)72-1臍橙；葉綠素水解酶

4、基因表達(dá)在10至12月中旬其表達(dá)強(qiáng)度較奉節(jié)72-1臍橙弱,翌年1月份則有較強(qiáng)的表達(dá)。
　　 3.通過對(duì)果實(shí)成熟過程中的糖分積累分析表明,奉節(jié)晚橙和奉節(jié)72-1臍橙果實(shí)在成熟過程中兩個(gè)品種的糖分變化差異主要發(fā)生在果肉組織,且奉節(jié)晚橙果肉中三種糖分含量在12月中旬之前是顯著低于奉節(jié)72-1臍橙果肉中的糖分含量,而在元月份后則明顯高于后者；果皮中奉節(jié)晚橙的蔗糖含量在果實(shí)成熟前期兩個(gè)時(shí)期(10月11日和11月3日)顯著低于奉節(jié)72-1臍

5、橙。而蔗糖相關(guān)代謝酶基因表達(dá)分析表明,兩個(gè)品種果肉中酸性轉(zhuǎn)化酶和蔗糖合酶的基因表達(dá)表現(xiàn)明顯差異,這種差異部分影響了奉節(jié)晚橙和奉節(jié)72-1果實(shí)間的糖分差異。
　　 4.奉節(jié)晚橙和奉節(jié)72-1臍橙果肉酸積累分析發(fā)現(xiàn)奉節(jié)晚橙在成熟前期檸檬酸含量顯著高于奉節(jié)72-1臍橙,而在后期(11月底始)則低于后者；在果實(shí)成熟中期,奉節(jié)晚橙節(jié)果酸含量顯著低于對(duì)照品種。檸檬酸代謝相關(guān)酶基因表達(dá)分析表明檸檬酸合成酶和順烏頭酸酶基因表達(dá)在兩個(gè)品種間表現(xiàn)差

6、異,而造成奉節(jié)晚橙檸檬酸含量與奉節(jié)72-1的差異可能與此時(shí)奉節(jié)晚橙果肉中檸檬酸合酶基因表達(dá)較強(qiáng)和順烏頭酸酶基因表達(dá)受抑制相關(guān)。
　　 5.利用分子標(biāo)記技術(shù),SSR和AFLP對(duì)兩個(gè)品種的DNA差異進(jìn)行分析,未發(fā)現(xiàn)兩個(gè)品種間在DNA水平上可重復(fù)的差異。
　　 6.采用cDNA-AFLP技術(shù)分析了兩個(gè)品種的果實(shí)在成熟過程中轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá),并對(duì)cDNA-AFLP的結(jié)果進(jìn)行了進(jìn)一步驗(yàn)證。實(shí)驗(yàn)篩選了120對(duì)選擇性引物,總共獲得近20

7、000多條清晰帶,結(jié)果發(fā)現(xiàn)其中有34對(duì)引物出現(xiàn)差異帶,檢測(cè)到144條清晰的轉(zhuǎn)錄差異帶(TDFs)。在成功回收的129個(gè)TDFs中,通過測(cè)序和序列比對(duì)(Blastx)分析表明表達(dá)差異片段主要與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)錄因子、成熟衰老、抗逆性、核糖體蛋白和DNA復(fù)制等有關(guān)。
　　 7.利用RACE技術(shù),以cDNA-AFLP技術(shù)獲得的差異片段為基礎(chǔ)克隆了6個(gè)與成熟相關(guān)的基因,分別命名為CitPG(EF185420)、CitCAD(EF185415

8、)、CitMads(EF185417)、CitMAP(EF185418),CitNAC(EF185419)、CitEREBP(EF185416),除了MADs-box基因外,其它5個(gè)目前在柑橘中還未見報(bào)道,且CitMads與目前報(bào)道的柑橘M(fèi)ads-box基因序列不同。表達(dá)分析表明在果實(shí)成熟過程中,他們?cè)趦蓚€(gè)品種的果皮或果肉組織中有表達(dá)差異,可能與晚熟性狀的表現(xiàn)有關(guān)。
　　 以上研究結(jié)果表明,相對(duì)奉節(jié)72-1臍橙,奉節(jié)晚橙在許多方

9、面發(fā)生了改變,這種性狀的改變很顯然不是因?yàn)槟骋幌嚓P(guān)指標(biāo)因子發(fā)生突變而引起局部性狀發(fā)生改變,而確實(shí)是果實(shí)成熟過程或發(fā)育過程整體延遲所致。而導(dǎo)致這種整體改變可能是在表達(dá)水平上而非在DNA水平發(fā)生改變。由于果實(shí)成熟是一個(gè)綜合而又復(fù)雜的過程,而非躍變型柑橘果實(shí)是一個(gè)漸進(jìn)式的程序性過程,因此要使奉節(jié)晚橙整體協(xié)調(diào)發(fā)生改變,那么這種改變的發(fā)生很有可能在果實(shí)發(fā)育過程或成熟過程發(fā)生的上游某個(gè)階段,即可能是啟動(dòng)果實(shí)成熟開始的一個(gè)‘開關(guān)’發(fā)生變化,從而導(dǎo)致奉