轉(zhuǎn)Bt crylAh和crylIe基因抗蟲(chóng)玉米的研究.pdf

1、近年來(lái),隨著轉(zhuǎn)基因作物種植面積的不斷加大,昆蟲(chóng)產(chǎn)生抗性的問(wèn)題已引起廣泛關(guān)注。延緩抗性產(chǎn)生的策略很多,其中最常用的是“高劑量／避難所”策略,但是由于國(guó)內(nèi)農(nóng)業(yè)的實(shí)際情況,“高劑量／避難所”策略很難在我國(guó)得以實(shí)施,“多基因”策略則為我們治理抗性產(chǎn)生的問(wèn)題提供了一條新的途徑。
　　 BtcrylAh基因是從蘇云金芽胞桿菌(Bacillus thuringiensis,Bt)菌株BT8中克隆的新型殺蟲(chóng)蛋白基因,其編碼蛋白對(duì)鱗翅目害蟲(chóng)的殺蟲(chóng)

2、活性強(qiáng)于目前使用的crylA類基因,而crylIe基因是另一個(gè)具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的Bt殺蟲(chóng)基因,其編碼蛋白對(duì)敏感玉米螟和抗性玉米螟均有一定毒力。同時(shí),crylIe與crylA類基因無(wú)交互抗性,將crylAh和crylIe基因構(gòu)建到同一表達(dá)載體中,能夠更為有效地克服現(xiàn)有Bt基因同源性高、種類單一、昆蟲(chóng)對(duì)Bt蛋白產(chǎn)生抗性等問(wèn)題,以期獲得抗蟲(chóng)性更好的玉米新品種。
　　 本研究構(gòu)建了三個(gè)分別含有crylAh單基因,crylIe單基因及cr

3、ylAh和crylIe雙基因的植物表達(dá)載體,通過(guò)MluⅠ酶切回收三個(gè)表達(dá)盒片段,利用基因槍法轉(zhuǎn)化玉米愈傷組織,以2mG2-epsps為篩選標(biāo)記基因,以草甘膦異丙胺鹽作為篩選劑,共得到了48株再生植株,其中PCR陽(yáng)性的有37株,分別屬于20個(gè)轉(zhuǎn)化事件。通過(guò)T0和T1代PCR和Southern blot檢測(cè),證明了crylAh和crylIe基因已經(jīng)整合到玉米基因組中,并穩(wěn)定遺傳。通過(guò)RT-PCR、Western blot和ELISA分析,證

4、明了兩個(gè)基因能夠正確的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。在不同的轉(zhuǎn)基因株系中CrylAh蛋白的表達(dá)量有所差異,而攜帶有crylAh和crylIe基因的轉(zhuǎn)基因玉米中CrylAh蛋白的表達(dá)量與僅含有crylAh基因的植株中CrylAh蛋白的表達(dá)量無(wú)顯著差異。田間生物活性檢測(cè)結(jié)果顯示,攜帶有crylAh和crylIe雙基因的轉(zhuǎn)基因玉米田間抗蟲(chóng)性要好于攜帶單基因的轉(zhuǎn)基因玉米,可見(jiàn)兩種Bt基因在轉(zhuǎn)基因玉米中能夠協(xié)同作用,攜帶兩種Bt基因的轉(zhuǎn)基因植株比僅含其中一個(gè)基因的