轉(zhuǎn)Bt-pta基因水稻后代分子檢測(cè)與抗蟲性鑒定.pdf

1、水稻是世界上最重要糧食作物之一，世界上近半數(shù)人口以稻米為食。一直以來，蟲害是危害水稻產(chǎn)量的重要因素之一，而利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)培育抗蟲水稻，可以有效解決這個(gè)問題。本研究以優(yōu)良水稻恢復(fù)系輻恢838為受體材料，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，將重組表達(dá)載體pCAMBIA1301-Bt-pta轉(zhuǎn)入其中，通過報(bào)告基因GUS表達(dá)檢測(cè)，目的基因PCR檢測(cè)，篩選出陽性T0代轉(zhuǎn)基因水稻；將其收獲后種植，對(duì)其進(jìn)行報(bào)告基因GUS表達(dá)檢測(cè)，及目的基因PCR檢測(cè)，檢測(cè)出T1代雙價(jià)

2、轉(zhuǎn)基因水稻，對(duì)其進(jìn)行抗蟲性鑒定；將抗蟲效果較好的雙價(jià)轉(zhuǎn)基因水稻收獲后種下，得到T2代轉(zhuǎn)基因水稻，每個(gè)株系取10株，對(duì)目的基因進(jìn)行PCR檢測(cè)，獲得純合的雙價(jià)抗蟲轉(zhuǎn)基因水稻。
　　本論文獲得的具體結(jié)果如下：
　　1.構(gòu)建雙價(jià)植物表達(dá)載體：首先構(gòu)建中間載體，用HindⅢ和SpeI分別對(duì)基礎(chǔ)表達(dá)載體pCAMBIA1301和質(zhì)粒pUC57-Bt進(jìn)行雙酶切，回收目的基因Bt和載體骨架pCAMBIA1301，然后通過T4 DNA連接酶將目

3、的基因連接到載體骨架上，構(gòu)建中間載體pCAMBIA1301-Bt；然后用HindⅢ分別酶切pCU57-pta與中間載體pCAMBIA1301-Bt，回收目的基因與中間載體骨架，再用T4 DNA連接酶將目的基因pta連接到中間載體骨架上，成功構(gòu)建植物表達(dá)質(zhì)粒pCAMBIA1301-Bt-pta。
　　2. T0代轉(zhuǎn)基因水稻的獲得及初步檢測(cè)：用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將雙價(jià)植物表達(dá)載體pCAMBIA1301-Bt-pta轉(zhuǎn)化優(yōu)良水稻恢復(fù)系輻恢83

4、8，經(jīng)馴化后移栽共獲得105株再生植株，經(jīng)過GUS化學(xué)組織染色及PCR檢測(cè)，最終得到3個(gè)T0代轉(zhuǎn)雙價(jià)基因陽性轉(zhuǎn)化子。
　　3. T1代轉(zhuǎn)基因水稻的分子檢測(cè)及抗蟲性鑒定：將分單株收獲的T0代轉(zhuǎn)基因水稻種子種下，得到T1代轉(zhuǎn)基因水稻株系，檢測(cè)其報(bào)告基因GUS表達(dá)水平，并對(duì)初步檢測(cè)出的陽性植株進(jìn)行目的基因PCR檢測(cè)、Bt毒蛋白表達(dá)酶聯(lián)免疫檢測(cè)以及室內(nèi)和室外的抗蟲性檢測(cè)，共檢測(cè)出29株抗蟲效果較好的雙價(jià)轉(zhuǎn)基因水稻，并對(duì)其農(nóng)藝性狀進(jìn)行考察。