紅皮梨色澤變異系的分子標(biāo)記鑒定及遺傳差異分析.pdf

1、果皮的色澤是果實(shí)外觀品質(zhì)的核心內(nèi)容，也是影響其商品價(jià)值的重要指標(biāo)。在我國(guó)的水果消費(fèi)市場(chǎng)上，色澤鮮艷的水果總是更加受到消費(fèi)者的青睞。近年來(lái)，優(yōu)質(zhì)紅皮梨品種的栽培成為一個(gè)新發(fā)展熱點(diǎn)，培育紅色果皮的梨新品種也成為梨種質(zhì)創(chuàng)新的一項(xiàng)重要研究?jī)?nèi)容。相對(duì)于蘋(píng)果、柑橘、葡萄等水果，有關(guān)梨果皮色澤形成的研究報(bào)道較少，研究進(jìn)展相對(duì)滯后。因此，本研究以幾組紅色及其綠色變異系梨品種為研究試材，開(kāi)展了分子標(biāo)記鑒定以及遺傳表達(dá)分析，以期從分子水平上揭示形成色澤差異

2、的原因，從而為探明梨紅色果皮形成的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。具體研究結(jié)果如下:
　　一、利用AFLP和SRAP標(biāo)記對(duì)3組梨果皮色澤變異品種（系）進(jìn)行鑒別。54對(duì)AFLP引物共檢測(cè)1089個(gè)位點(diǎn)，其中多態(tài)性條帶數(shù)為688，多態(tài)性比率為63.2％;20對(duì)SRPA引物可檢測(cè)210個(gè)位點(diǎn)，其中多態(tài)性條帶為76條，多態(tài)性比率為36.2％。分析結(jié)果表明，7對(duì)AFLP引物、3對(duì)SRAP引物可區(qū)分南果與其紅色變異系;3對(duì)AFLP引物、1對(duì)SRPA引物可區(qū)

3、分考密斯、紅考密斯、早紅考密斯與其綠色變異系;所檢測(cè)的引物均無(wú)法區(qū)分紅安久及其綠色變異系。綜合AFLP與SRAP標(biāo)記的檢測(cè)結(jié)果，獲得4個(gè)品種（系）的特征譜帶，SRPA引物em11/me5可區(qū)分除紅安久及其變異系以外的所有供試材料，可應(yīng)用于各品種（系）的分子鑒別。
　　二、以早紅考密斯及其綠色變異系為試材，研究果實(shí)不同發(fā)育期果皮中花青素含量的動(dòng)態(tài)變化及含量差異。結(jié)果表明，早紅考密斯及其綠色變異系的花青素發(fā)育動(dòng)態(tài)變化均呈現(xiàn)先上升后下降

4、再上升的趨勢(shì)，早紅考密斯在花后40天，花青素含量達(dá)到最大值，為298mg/g;早紅考密斯綠色變異系在花后55天花青素含量達(dá)到最大值，為35.4mg/g。在整個(gè)發(fā)育期內(nèi)，早紅考密斯的花青素含量均高于綠色變異系;與旱紅考密斯果實(shí)相比，綠色變異系在花后70天時(shí)花青素含量相差最大，此時(shí)，紅色果皮花青素含量是綠色變異系的9.90倍。由此得出:早紅考密斯的花青素含量顯著高于綠色誘變系，花青素的含量水平差異是影響其形成色澤差異的重要因素。
　　

5、三、以早紅考密斯及其綠色變異系為試材，利用cDNA-AFLP技術(shù)進(jìn)行差異表達(dá)分析。分別提取兩個(gè)供試材料花后40天的果皮RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA,并采用64對(duì)AFLP引物組合進(jìn)行表達(dá)分析。其中60對(duì)AFLP引物組合能擴(kuò)增出穩(wěn)定、清晰的條帶，共得到穩(wěn)定差異位點(diǎn)數(shù)47個(gè)。將47條差異條帶進(jìn)行回收、克隆、測(cè)序，得到EST序列并進(jìn)行BLAST比對(duì)，分析結(jié)果表明20條片段為已知功能基因序列，20條為功能未知基因序列，7條比對(duì)無(wú)結(jié)果;對(duì)已知功能的20

6、個(gè)EST序列進(jìn)一步進(jìn)行功能分類(lèi)分析，包括信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)基因1個(gè)，標(biāo)記基因4個(gè)，轉(zhuǎn)錄因子2個(gè)，抗病防衛(wèi)基因11個(gè)，初級(jí)代謝調(diào)控蛋白1個(gè)，參與花青素合成相關(guān)的基因1個(gè)。本研究中將克隆的參與花青素合成的表達(dá)序列命名為PyMADS18，其與MADS-box轉(zhuǎn)錄因子高度同源。
　　四、以不同發(fā)育期的早紅考密斯及其綠色變異系果皮為研究試材，對(duì)PyMADS18差異基因（與MADS-box高度同源）進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析。旱紅考密斯果實(shí)整個(gè)發(fā)育期，

7、果皮中PyMADS18基因表達(dá)量動(dòng)態(tài)變化為先下降后上升，花后40天表達(dá)量最大(1.00)，這與花青素含量變化動(dòng)態(tài)相一致;在早紅考密斯綠色變異系果實(shí)整個(gè)發(fā)育期，果皮中PyMADS18基因表達(dá)量動(dòng)態(tài)變?yōu)橄壬仙笙陆翟偕仙ê?5天表達(dá)量最高(0.53)，其變化動(dòng)態(tài)與花青素含量動(dòng)態(tài)變化也相符合。以上結(jié)果表明，花青素pYMADS18基因的表達(dá)與花青素含量呈正相關(guān)，參與花青素的合成，影響花青素的積累。同一時(shí)期紅色果皮與綠色變異系的比較表明，花后