西雙版納熱帶雨林土壤微生物群落結(jié)構(gòu)多樣性及其木質(zhì)素降解酶相關(guān)基因資源的宏基因組學(xué)研究.pdf

1、木質(zhì)纖維素是地球上儲(chǔ)量最為豐富的可再生有機(jī)碳源，開(kāi)發(fā)以木質(zhì)纖維類原料替代糧食資源的燃料乙醇技術(shù)，是未來(lái)解決燃料乙醇原料成本高、原料有限的根本出路。本文利用分子生態(tài)學(xué)技術(shù)研究土壤木質(zhì)纖維素降解過(guò)程中微生物群落結(jié)構(gòu)及其動(dòng)態(tài)演化規(guī)律，挖掘不同階段的優(yōu)勢(shì)菌群，探索未來(lái)木質(zhì)纖維素商品化利用的新策略。以西雙版納地區(qū)熱帶雨林土壤為研究對(duì)象，以提取的土壤總基因組DNA為模板，分別PCR擴(kuò)增細(xì)菌的16S rRNA基因和真菌的18S rRNA基因，構(gòu)建16

2、S rRNA及18S rRNA基因文庫(kù)，并進(jìn)行了PCR-RFLP分析。通過(guò)對(duì)75個(gè)不同RFLP帶型所代表的細(xì)菌克隆和26個(gè)不同RFLP帶型所代表的真菌克隆進(jìn)行了測(cè)序、分析以及系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建，分別分析了該土壤中的細(xì)菌和真菌群落結(jié)構(gòu)。結(jié)果表明，西雙版納地區(qū)熱帶雨林土壤主要的細(xì)菌菌群為Acidobacteria、Proteobacteria、Actinobacteria和一個(gè)未分類的細(xì)菌類群。其中Acidobacteria是細(xì)菌菌群的絕對(duì)

3、優(yōu)勢(shì)菌群，占總克隆數(shù)的89.4％，包含Gp1、Gp2、Gp3和Gp5四個(gè)大簇。而真菌菌落大致可以分為三大菌群：Fungi incertae sedis、Ascomycota和Basidiomycota。Fungiincertae sedis是第一大類群，占63.0％，包括Mucoromycotina和unclassifiedZgomycetes兩大亞類群。Ascomycota次之，占總克隆數(shù)的32.4％，而B(niǎo)asidiomycota在此

4、克隆文庫(kù)當(dāng)中檢出比例僅占克隆總數(shù)的4.6％。從已鑒別的微生物類群中，大多數(shù)真菌類群，如Basidiomycota門(mén)的Cryptococcus和Panaeolus；Ascomycota門(mén)的Tricladium、Aspergillus、Penicillium和Neurospora菌屬等都被報(bào)道具有木質(zhì)纖維素分解能力。
　　 參與土壤中木質(zhì)纖維素生物降解的微生物類群不僅具有多樣性，而且降解過(guò)程按一定的次序進(jìn)行，參與的微生物類群顯示出明

5、顯的演替規(guī)律。以天然木質(zhì)纖維素為主要培養(yǎng)基質(zhì)，分別選取培養(yǎng)8天和15天的土樣再次構(gòu)建真菌的18S rRNA基因文庫(kù)。隨機(jī)挑取克隆子進(jìn)行PCR-RFLP帶型分析，并與先前的帶型結(jié)果進(jìn)行對(duì)比，統(tǒng)計(jì)帶型比例的變化，并對(duì)新的帶型（培養(yǎng)8天出現(xiàn)16個(gè)新帶型、15天出現(xiàn)11個(gè)新帶型）對(duì)應(yīng)的克隆測(cè)序分析。結(jié)果表明，培養(yǎng)的不同階段真菌群落結(jié)構(gòu)不斷變化，其優(yōu)勢(shì)菌群也隨之變化。最初，以子囊菌類營(yíng)腐生的污染性機(jī)會(huì)菌數(shù)量和種類為主，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，子囊菌類

6、逐漸減少，而擔(dān)子菌類木腐菌的數(shù)量和種類逐漸增多并最終占主要優(yōu)勢(shì)。
　　 微生物對(duì)木質(zhì)纖維素的降解主要通過(guò)分泌一系列的酶系來(lái)完成。擔(dān)子菌在整個(gè)降解過(guò)程中分布具有持續(xù)的連貫性，并且它是土壤中的主要木腐菌類。我們以擔(dān)子菌的木質(zhì)素降解酶基因作為主要考察指標(biāo)，進(jìn)一步從酶基因水平追蹤和解釋微生物降解木質(zhì)纖維素的演替變化規(guī)律。根據(jù)已公布的擔(dān)子菌漆酶基因保守序列設(shè)計(jì)特異引物，以提取的土壤基因組總DNA為模板，PCR擴(kuò)增了140 bp的擔(dān)子菌種群

7、漆酶基因銅離子結(jié)合保守區(qū)與序列。用地高辛標(biāo)記此段序列作為探針，通過(guò)菌落原位雜交從已構(gòu)建的西雙版納土壤宏基因組文庫(kù)中篩選含有該漆酶基因片段的陽(yáng)性克隆子。通過(guò)篩選大約30000個(gè)宏基因組克隆，最終一共獲得了六個(gè)有雜交信號(hào)的克隆子。對(duì)其中的一個(gè)陽(yáng)性克隆子進(jìn)行亞克隆并測(cè)序，獲得的測(cè)序結(jié)果與Gluconolactonase具有較高的同源性。Gluconolactonase和漆酶同屬于氧化酶家族，因此可能參與了木質(zhì)素的氧化過(guò)程。繼續(xù)對(duì)陽(yáng)性克隆子進(jìn)行