基因傳感器檢測(cè)木質(zhì)素降解酶基因及堆肥群落多樣性研究.pdf_第1頁(yè)
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1、堆肥化技術(shù)在城市生活垃圾處理中已經(jīng)得到越來(lái)越廣泛地應(yīng)用。堆肥系統(tǒng)中,微生物降解木質(zhì)素的代謝過(guò)程由一系列酶共同完成,而錳過(guò)氧化物酶(MnP)和纖維二糖脫氫酶(CDH)在其中起了關(guān)鍵性作用。用DNA生物傳感器檢測(cè)其編碼基因,能更好地了解這兩種酶的協(xié)同作用。本研究擬制備固定化核酸探針傳感器用于檢測(cè)黃孢原毛平革菌錳過(guò)氧化物酶和纖維二糖脫氫酶的編碼基因,探討DNA傳感器用于同時(shí)檢測(cè)兩種堆肥高效降解菌產(chǎn)酶基因的可行性。同時(shí)運(yùn)用PCR-DGGE技術(shù)對(duì)

2、堆肥中微生物群落多樣性進(jìn)行了研究。
   首先研究了DNA生物傳感器單獨(dú)檢測(cè)黃孢原毛平革菌錳過(guò)氧化物酶編碼基因。利用自組裝單分子膜技術(shù),將毓基修飾的探針固定在金電極表面。采用交流阻抗法和循環(huán)伏安法,表征疏基修飾的ssDNA在金電極上的固定及雜交過(guò)程。再用計(jì)時(shí)電流法掃描,得出電化學(xué)信號(hào)與目標(biāo)鏈濃度間的線性關(guān)系。研究了目標(biāo)序列的線性檢測(cè)范圍、特異性以及各種影響因素。該傳感器的線性范圍為4×10-1~1×10-12 M,檢測(cè)限為1.0

3、×10-12M。
   接著,將巰基修飾的兩種木質(zhì)素降解酶-錳過(guò)氧化物酶、纖維二糖脫氫酶的寡核苷酸探針通過(guò)自組裝的方法固定在金電極表面。通過(guò)靶基因序列與其互補(bǔ)鏈之間夾心式雜交后序列的高度選擇性和極強(qiáng)的分子識(shí)別能力,將辣根過(guò)氧化物酶、漆酶分別標(biāo)記在不同的酶基因上,利用酶標(biāo)的不同催化反應(yīng)將雜交信號(hào)放大,實(shí)現(xiàn)對(duì)兩種木質(zhì)素降解酶編碼基因同時(shí)進(jìn)行電化學(xué)檢測(cè)。錳過(guò)氧化物酶、纖維二糖脫氫酶靶基因序列的濃度分別在1.0×10-11~4.0×10

4、-8M和1.0×10-10~4.0×10-8M范圍時(shí),其濃度的對(duì)數(shù)值和兩種酶催化反應(yīng)產(chǎn)生的電流變化值呈線性相關(guān)關(guān)系,相關(guān)系數(shù)分別為0.9884和0.9881,檢出限分別為1.0×1011 M和5.0×10-11 M。同一目標(biāo)鏈濃度均平行測(cè)定三次,其RSD分別為4.30%和3.52%。該傳感器特異性強(qiáng),靈敏度高,重復(fù)性和穩(wěn)定性也較好。
   最后,通過(guò)PCR-DGGE(變性梯度凝膠電泳)方法分析了堆肥過(guò)程中微生物群落結(jié)構(gòu)多樣性及其

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