黃姑魚抗體檢測技術(shù)及其產(chǎn)生規(guī)律研究.pdf

1、目的：
　　 本研究采用微生物技術(shù)、蛋白質(zhì)技術(shù)和免疫學(xué)技術(shù)等技術(shù)手段純化黃姑魚IgM,制備兔抗魚IgM多克隆抗體,建立黃姑魚抗體檢測技術(shù),研究分析受免黃姑魚的抗體產(chǎn)生規(guī)律,同時(shí),研究黃姑魚對副溶血弧菌滅活疫苗的免疫應(yīng)答能力。為黃姑魚細(xì)菌性疾病的人工免疫防治提供理論依據(jù),為黃姑魚人工免疫的疫苗接種途徑和加強(qiáng)免疫時(shí)間等提供數(shù)據(jù)支撐。
　　 方法：
　　 1.采用飽和硫酸銨沉淀法和葡聚糖凝膠SephadexG-200凝

2、膠柱層析,分離和純化黃姑魚免疫球蛋白,然后采用SDS-PAGE分析純化蛋白的部分特性,將其作為免疫原再免疫接種新西蘭大白兔制備兔抗黃姑魚IgM多克隆抗體。
　　 2.建立間接ELISA測定黃姑魚抗體水平的技術(shù)方法,確定抗原包被濃度和檢測血清最佳工作濃度,二抗和酶標(biāo)三抗最適稀釋倍數(shù),抗原包被條件的選擇,底物的最佳反應(yīng)時(shí)間等間接ELISA的實(shí)驗(yàn)條件。
　　 3.通過注射和浸泡兩種不同免疫方式接種黃姑魚后,應(yīng)用間接ELISA法

3、對黃姑魚血清中抗體水平進(jìn)行檢測,分析抗體在黃姑魚體內(nèi)的產(chǎn)生規(guī)律。
　　 結(jié)果：
　　 1.通過硫酸銨沉淀法和SephadexG-200凝膠柱層析方法分離,獲得純度較高的免疫球蛋白,經(jīng)β-巰基乙醇處理后解離形成重鏈和輕鏈兩個(gè)亞單位,分子量分別為72.4 kD、28.8 kD,表明黃姑魚血清IgM的分子量與硬骨魚IgM的分子量范圍(H鏈60 kD-81kD,L鏈20 kD.30kD)是一致。然后以純化后的黃姑魚IgM作為免疫

4、原接種新西蘭兔制備兔抗黃姑魚:IgM多克隆抗體。
　　 2.建立了間接ELISA測定黃姑魚抗體的方法,試驗(yàn)的最佳反應(yīng)條件為:抗原最適工作濃度濃度為1×10 cfu/mL,包被4℃過夜；檢測血清稀釋度分別為1:80；自制兔抗黃姑魚IgG作1:80稀釋；購買的羊抗兔IgG-HRP酶標(biāo)抗體作1:3000稀釋；選擇底物的最佳反應(yīng)時(shí)間為15min。
　　 3.研究得出了黃姑魚接種副溶血弧菌滅活疫苗后抗體的產(chǎn)生規(guī)律。注射免疫接種不同

5、濃度副溶血弧菌滅活疫苗后,黃姑魚抗體水平從第7 d開始逐步升高,在免疫后28d達(dá)到峰值,隨后逐漸下降；浸泡免疫組則在第21 d達(dá)到峰值,隨后逐漸下降。
　　 4.注射和浸泡低濃度疫苗的黃姑魚產(chǎn)生的抗體水平都要低于高濃度組的黃姑魚抗體水平；免疫后相同時(shí)間條件下,注射組抗體水平高于浸泡組水平。注射免疫三組中滅活疫苗濃度為1×108cfu/ml免疫效果較好,顯著高于其它各組。
　　 結(jié)論：
　　 1、成功純化出黃姑魚血

6、清IgM,重鏈和輕鏈的分子量分別為72.4 kD、28.8 kD；
　　 2、制備了兔抗黃姑魚IgM多克隆抗體。
　　 3、建立了黃姑魚抗體間接ELISA檢測技術(shù),間接ELISA測定黃姑魚抗體的方法,最佳反應(yīng)條件為:抗原最適工作濃度濃度為1×108cfu/mL,包被4℃過夜；檢測血清稀釋度分別為1:80；自制兔抗黃姑魚IgG作1:80稀釋；購買的羊抗兔IgG-HRP酶標(biāo)抗體作1:3000稀釋；選擇底物的最佳反應(yīng)時(shí)間為15