小黑麥耐鹽堿相關(guān)基因克隆及其功能驗證.pdf

1、目的：土地鹽漬化是嚴(yán)重影響農(nóng)業(yè)生態(tài)環(huán)境、限制農(nóng)業(yè)生產(chǎn)可持續(xù)發(fā)展的一個重要因素。鹽堿耕地上種植的作物表現(xiàn)為大幅的減產(chǎn)甚至死亡。目前，培育優(yōu)良的耐鹽堿作物品種是解決這一問題的方法之一。因此，應(yīng)用分子生物學(xué)及基因工程手段培育耐鹽堿作物新品種已成為當(dāng)前現(xiàn)代農(nóng)業(yè)研究的重要內(nèi)容之一。
　　 方法：本研究以六倍體小黑麥品種為主要研究材料，建立了小黑麥cDNA-AFLP技術(shù)，并以此為基礎(chǔ)篩選到與鹽脅迫相關(guān)的基因片段，采用RACE技術(shù)擴增到了碳酸

2、酐酶cDNA全長，通過半定量RT-PCR和酶活性分析技術(shù)對該基因和蛋白表達(dá)進(jìn)行了分析，并利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化擬南芥技術(shù)對該基因的功能進(jìn)行了驗證。
　　 結(jié)果：
　　 1.利用cDNA-AFLP方法，采用64對引物從具有不同耐鹽堿性能的小黑麥鹽脅迫前后材料中篩選出了6個與耐鹽性密切相關(guān)基因片段，如與磷酸酰絲氨酸脫羧酶、碳酸酐酶、受體類激酶、光系統(tǒng)II32kDa蛋白、光系統(tǒng)I疏水蛋白（PSI），應(yīng)激反應(yīng)蛋白的cDNA差異片段

3、，首次在小黑麥育種上使用了cDNA-AFLP技術(shù)。
　　 2.以42號碳酸酐酶cDNA片段為基礎(chǔ)，通過RACE技術(shù)擴增到了小黑麥碳酸酐酶（CA）全長cDNA，其序列長為1114bp，基因BANK登錄號：GU145385，其中其 5′非編碼區(qū)為24bp，開放閱讀框長為778bp，3′非編碼區(qū)為310bp，編碼266個氨基酸。該小黑麥CA cDNA全長序列經(jīng)在NCBI中的同源性比對，與大麥的β-CA基因（登錄號：L36959.1）同

4、源性為 92％。經(jīng)Clustal x軟件對其蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測表明，該CA基因所編碼的蛋白質(zhì)具有典型的β-CA基因家族的鋅原子的結(jié)合殘基，可初步斷定其為小黑麥β-CA基因。
　　 3.運用酶活性分析和半定量RT-PCR技術(shù)，對該小黑麥CA基因在蛋白和分子水平的表達(dá)進(jìn)行了研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)小黑麥幼苗葉片中的CA活性對鹽脅迫脅迫反應(yīng)靈敏。在抗鹽性能不同的小黑麥品種間，CA活性對鹽脅迫的響應(yīng)也存在著差異，表明小黑麥CA是一個鹽脅迫響應(yīng)上調(diào)基因