高粱耐鹽堿種質(zhì)資源篩選及木質(zhì)素合成相關(guān)基因鑒定.pdf

1、由于石油、天然氣和煤炭等不可再生能源的常年開采而逐漸面臨資源枯竭，全球正遭遇著越來越嚴(yán)重的能源危機(jī)。我國(guó)地域廣闊、人口眾多，資源豐富，但人均資源則相對(duì)匱乏，隨著我國(guó)經(jīng)濟(jì)的高速發(fā)展，對(duì)能源需求量巨大，能源危機(jī)更為突出。因此，探索可再生、可持續(xù)、無污染、高效清潔的新能源已成為我國(guó)乃至全球科學(xué)家重點(diǎn)研究的目標(biāo)之一。生物乙醇作為唯一一種能以液態(tài)形式存在的新能源，是我國(guó)現(xiàn)階段最有可能實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的主要生物能源產(chǎn)品之一，也是我國(guó)生物能源產(chǎn)業(yè)發(fā)展的

2、重點(diǎn)。以糧食和油料作物為原料來生產(chǎn)乙醇可能會(huì)威脅國(guó)家糧油食品安全，而植物纖維素則是一種非常有潛力、前景廣闊的生物乙醇的生產(chǎn)原料。我國(guó)有大量的鹽堿地、荒地、次生退化土壤，因此結(jié)合我國(guó)國(guó)情，充分利用好這些宜耕邊際性土地，篩選、培育適應(yīng)性好、抗逆性強(qiáng)、具有較高生物量的能源作物高粱等，為生物乙醇生產(chǎn)提供大量?jī)?yōu)質(zhì)原料具有重要意義。
　　高粱具有C4植物的高光合效率，抗逆性強(qiáng)，生長(zhǎng)期短，適應(yīng)性廣。即使在貧瘠、鹽堿、干旱土地上種植也有較高產(chǎn)量和

3、生物量。此外高梁基因組較小，有豐富的種質(zhì)資源和生物信息學(xué)資源，又有大量EMS誘發(fā)的突變體，因此有必要選擇出其中的耐鹽堿種類進(jìn)行深入研究、分析，培育出能在鹽堿地、旱地正常生長(zhǎng)發(fā)育的能源高粱新品系，對(duì)大量黃/褐中脈突變體的研究，有利于從分子機(jī)理上了解木質(zhì)素代謝的調(diào)控，為進(jìn)一步通過基因工程改良能源高粱創(chuàng)造條件。
　　植物通過光合作用將絕大部分有機(jī)物轉(zhuǎn)化為細(xì)胞壁成分，其主要成分為纖維素、半纖維素、木質(zhì)素。木質(zhì)素的水解產(chǎn)物影響纖維素酶對(duì)纖維

4、素的水解效率，使纖維素轉(zhuǎn)化為乙醇的成本提高。因此有必要系統(tǒng)認(rèn)識(shí)高粱木質(zhì)素合成及其基因表達(dá)調(diào)控的分子機(jī)制，分離木質(zhì)素合成調(diào)控的關(guān)鍵基因。多種作物黃/褐色中脈(bmr)突變體的木質(zhì)素含量明顯降低，是研究木質(zhì)素合成及調(diào)控的良好試驗(yàn)材料。但是至今為止，僅對(duì)少數(shù)bmr突變體與木質(zhì)素合成的關(guān)系有所了解，大多數(shù)的突變體還有待于進(jìn)一步研究。
　　為了尋找耐鹽堿的高梁品種，本論文對(duì)美國(guó)農(nóng)業(yè)部收集的高梁種質(zhì)資源進(jìn)行篩選，獲得抗鹽堿種質(zhì)材料，為在鹽堿地

5、發(fā)展能源植物提供了有用的實(shí)驗(yàn)材料;本論文同時(shí)通過抑制性差減(SSH)技術(shù)分別構(gòu)建13種bmr突變體混合體與BTx623野生型對(duì)照的正、反向差減文庫(kù);從正反向文庫(kù)中挑選cDNA片段制作基因芯片，分析其表達(dá)模式;根據(jù)基因的表達(dá)模式，從中篩選與木質(zhì)素合成及調(diào)控相關(guān)的EST片段，并進(jìn)一步克隆了部分差異表達(dá)基因;初步鑒定了這些基因的功能，為高粱及其它能源植物細(xì)胞壁成分的改良，培育低木質(zhì)素的新種類提供了有益的線索。
　　具體研究?jī)?nèi)容及結(jié)果包括

6、:
　　1.高梁耐鹽性種質(zhì)資源篩選
　　根據(jù)美國(guó)農(nóng)業(yè)部植物研究服務(wù)署(USDA-ARS)種植資源系統(tǒng)(NationalPlantGermplasmSystem)所收集管理的高粱信息，我們?cè)谄涫占?200多份甜高粱中選取錘度大于10，蔗糖含量高于4的甜高粱717份，及四萬多份粒用高粱中高度大于2，5米，整齊度小于2.5的粒用高梁4222份，重新編號(hào)，進(jìn)行大規(guī)模、高強(qiáng)度(150-200mmol/LNaCl)、長(zhǎng)時(shí)間(25-40

7、天)的耐鹽性篩選。通過對(duì)甜高粱的兩輪耐鹽性篩選，共得到了耐鹽株系83個(gè)，移栽成活65個(gè)株系，其中46個(gè)株系收到種子;對(duì)普通高梁進(jìn)行耐鹽堿篩選，并移種大田或花盆312個(gè)株系，大多數(shù)完成生活周期并獲得了種子。
　　在東營(yíng)鹽堿地中播種了31種篩選得到的耐鹽甜高粱，結(jié)果表明堿地中甜高粱的出苗率略高于鹽堿地。但其總生物量差異不大，鹽堿地單株平均重量比堿地高。多數(shù)甜高粱在鹽堿地中的錘度高于堿地。不同甜高梁的單株種子產(chǎn)量在鹽堿地和堿地差異很大。

8、鹽堿地生長(zhǎng)的甜高粱比同時(shí)播種在堿地的甜高梁提早成熟5-7天。
　　2.利用SSH和cDNA芯片技術(shù)分析bmr突變體和野生型高粱BTx623的表達(dá)差異
　　為了研究高粱bmr突變體細(xì)胞壁合成代謝及調(diào)控機(jī)制，我們用抑制性差減(SSH)文庫(kù)和cDNA芯片聯(lián)用的方式檢驗(yàn)了bmr突變體和野生型高粱BTx623的差異表達(dá)基因。共得到153個(gè)差異表達(dá)基因，其中43個(gè)在bmr突變體中上調(diào)表達(dá)，110個(gè)基因在bmr突變體中表達(dá)受抑制。我們對(duì)其

9、中12個(gè)差異表達(dá)基因進(jìn)行半定量RT-PCR驗(yàn)證，結(jié)果證明了基因芯片數(shù)據(jù)是正確的。差異表達(dá)基因根據(jù)功能不同可分為11類:代謝、光合作用、遺傳信息的加工、脅迫響應(yīng)、蛋白命運(yùn)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)運(yùn)、木質(zhì)素合成、細(xì)胞過程和移動(dòng)性、發(fā)育和調(diào)節(jié)及其它，其中代謝類的差異表達(dá)基因數(shù)量最多。光合作用類別的17個(gè)差異表達(dá)基因中，16個(gè)在bmr突變體中的表達(dá)都受到抑制，這一點(diǎn)和部分bmr突變體生物量減少的表型相一致。結(jié)果，我們從高粱bmr突變體中找到了一批差異表達(dá)

10、基因，其中的CYP基因在bmr突變體中表達(dá)下調(diào)，這與bmr突變體中木質(zhì)素含量降低一致;而木質(zhì)素合成的苯基丙烷途徑中的一個(gè)C4H基因，在bmr突變體中表達(dá)上調(diào)，該結(jié)果可能預(yù)示高粱的三個(gè)C4H在合成細(xì)胞壁的過程中，其功能有所分化:MYB、NAC、Lim等轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)在bmr突變體和野生型中沒有明顯的差異，但卻發(fā)現(xiàn)bHLH轉(zhuǎn)錄因子在多個(gè)bmr突變體中明顯上調(diào)表達(dá)。本文進(jìn)一步對(duì)這3個(gè)基因進(jìn)行了結(jié)構(gòu)、表達(dá)分析及功能的初步鑒定。
　　3.高

11、粱木質(zhì)素合成代謝相關(guān)基因的功能鑒定
　　SbHLH的功能研究
　　SbHLH是13種bmr突變株系與野生型SSH篩選和芯片雜交后得到的表達(dá)上調(diào)最高的一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子，該基因信號(hào)在芯片雜交結(jié)果中重復(fù)出現(xiàn)達(dá)6次之多，表明其可能是多種bmr突變體共有的一個(gè)調(diào)節(jié)信號(hào)。RT-PCR結(jié)果表明，7個(gè)bmr變體的葉片在7葉期該基因的表達(dá)也明顯上調(diào)。SbHLH在根、莖、葉中有不同的轉(zhuǎn)錄活性，在葉中表達(dá)量最高，莖中的表達(dá)量最低，這與該器官的木質(zhì)化程

12、度有密切關(guān)系。在酵母菌中，全長(zhǎng)SbHLH具有轉(zhuǎn)錄激活活性，表明它是一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子;缺失N端低復(fù)雜性區(qū)時(shí)，即使HLH結(jié)構(gòu)域完整存在也沒有轉(zhuǎn)錄活性，說明該低復(fù)雜性區(qū)對(duì)HLH結(jié)構(gòu)域及轉(zhuǎn)錄激活功能的重要性;C端缺失不能影響其轉(zhuǎn)錄激活能力。通過該蛋白偶聯(lián)GFP，基因槍法轉(zhuǎn)化洋蔥表皮，結(jié)果表明該基因表達(dá)產(chǎn)物定位在細(xì)胞核。在擬南芥中過表達(dá)SbHLH后，轉(zhuǎn)基因擬南芥的表型在幼苗期沒有明顯變化，也能JT常完成的生長(zhǎng)周期，但在后期由于莖伸長(zhǎng)，過表達(dá)系比野生型

13、容易發(fā)生倒伏。6周齡的冰凍切片染色結(jié)果及木質(zhì)素含量測(cè)定表明，過表達(dá)擬南芥莖的木質(zhì)素含量比野生型和空載體對(duì)照明顯降低，木質(zhì)素合成途徑和類黃酮/花青素合成途徑中部分相關(guān)基因的表達(dá)受到不同程度的抑制，如PAL1，4CL，CCR1，HCT，COMT，CHI，UGT等基因。因此，SbHLH很可能是苯基丙烷代謝途徑的轉(zhuǎn)錄抑制因子。
　　SbCYP功能研究
　　SbCYP基因在多個(gè)bmr突變體的7葉期中均呈現(xiàn)下調(diào)表達(dá)的趨勢(shì);與之相反，該基

14、因在野生型高粱(BTx623)的5葉期到7葉期的表達(dá)呈上調(diào)趨勢(shì)。在擬南芥中過表達(dá)SbCYP后，轉(zhuǎn)基因擬南芥能完成正常的生長(zhǎng)發(fā)育周期但在6周齡時(shí)的莖中，木質(zhì)素含量和野生型擬南芥沒有明顯差異，不過在8周齡過表達(dá)的擬南芥株系莖中，木質(zhì)素含量則明顯升高;同時(shí)部分木質(zhì)素合成相關(guān)基因(PAL1，4CLI，CCoAOMT，CCRI等基岡)也被誘導(dǎo)表達(dá)，這些結(jié)果說明SbCYP參與了木質(zhì)素的合成或調(diào)控。SbCYP的調(diào)控模式在bmr突變體與野生型高粱中明顯

15、不同，這可能是造成bmr突變體木質(zhì)素含量降低的原因之一，也可能是受到其它上游基因(例如SbHLH)調(diào)控后出現(xiàn)的效應(yīng)。
　　SbC4H功能研究
　　SbC4H基因在多個(gè)bmr突變體中都呈現(xiàn)出上調(diào)表達(dá)的趨勢(shì)。將SbC4H在擬南芥中過表達(dá)后，在6周齡的轉(zhuǎn)基因擬南芥，其莖中的木質(zhì)素的含量較野生型明顯降低，同時(shí)SbC4H過表達(dá)擬南芥中的部分木質(zhì)素合成相關(guān)基因(例如4CL1，4CL，F(xiàn)5H1)的表達(dá)受到一定的抑制。
　　總之，通過