小黑麥天冬酰胺合成酶基因克隆及功能驗(yàn)證.pdf

1、目的：植物在應(yīng)對(duì)干旱、鹽、礦物質(zhì)元素脅迫和病菌侵害時(shí)，其天冬酰胺合成酶基因表達(dá)量會(huì)提高，并積累大量天冬酰胺。天冬酰胺不僅是植物體內(nèi)運(yùn)輸新合成氮的重要載體，也是植物轉(zhuǎn)移衰老器官中氮源的重要載體。天冬酰胺合成酶基因的表達(dá)受到逆境環(huán)境因素誘導(dǎo)，是潛在的抗逆基因。本研究擬從適應(yīng)性廣泛的六倍體小黑麥中克隆天冬酰胺合成酶基因，并對(duì)其功能以及在鹽脅迫下的表達(dá)特點(diǎn)進(jìn)行分析，以進(jìn)一步明確小黑麥天冬酰胺合成酶基因與耐鹽性的關(guān)系。
　　方法：前期試驗(yàn)中

2、利用cDNA-AFLP技術(shù)從六倍體小黑麥中篩選到一條差異表達(dá)基因片段，本研究通過(guò)電子克隆技術(shù)獲得了小黑麥天冬酰胺合成酶基因（TriAS），并利用生物信息學(xué)手段對(duì)其進(jìn)行分析。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)對(duì)NaCl脅迫下的不同耐鹽性小黑麥品種中天冬酰胺合成酶表達(dá)特點(diǎn)進(jìn)行了檢測(cè)；構(gòu)建了 TriAS-PZP植物表達(dá)載體，并通過(guò)沾花法侵染擬南芥和葉盤法侵染煙草獲得了轉(zhuǎn)基因擬南芥與煙草。觀察鹽脅迫和干旱脅迫下轉(zhuǎn)基因擬南芥種子萌發(fā)、幼苗期和成株期的生理

3、表現(xiàn)，檢測(cè)各處理相應(yīng)階段SOD酶活性和MDA含量，同時(shí)以同樣方式檢測(cè)轉(zhuǎn)基因煙草。從而初步驗(yàn)證天冬酰胺合成酶基因功能。
　　結(jié)果：⑴TriAS基因特征。利用電子克隆技術(shù),從小黑麥中克隆到的天冬酰胺合成酶基因開(kāi)放閱讀框?yàn)?761bp，編碼587個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)蛋白分子量為65.83kD，在GeneBank中的注冊(cè)為KC193248。該基因預(yù)測(cè)蛋白與小麥、陸地棉等物種中天冬酰胺合成酶基因有高度同源性，初步推測(cè)其為小黑麥天冬酰胺合成酶,命名

4、為TriAS。其含有兩個(gè)保守區(qū)域，即1個(gè)谷氨酰胺氨基轉(zhuǎn)移結(jié)構(gòu)域和1個(gè)天冬酰胺合成酶結(jié)構(gòu)域。進(jìn)化分析顯示小黑麥天冬酰胺合成酶與小麥中的該酶親緣最近。⑵鹽脅迫下TriAS基因表達(dá)特點(diǎn)。在濃度150mmol/L NaCl脅迫下，新小黑麥3號(hào)和新小黑麥5號(hào)的基因表達(dá)都呈現(xiàn)先升高再降低趨勢(shì)，在葉中的表達(dá)量升高均顯著，但根部其表達(dá)量升高不顯著。在新小黑麥3號(hào)各組織中該酶基因表達(dá)量均高于新小黑麥5號(hào)。在新小黑麥3號(hào)中脅迫后36h表達(dá)量達(dá)到最大，而在新

5、小黑麥5號(hào)中脅迫后24h其表達(dá)量達(dá)到最大值。⑶轉(zhuǎn)TriAS基因擬南芥與煙草對(duì)逆境脅迫生理反應(yīng)在鹽脅迫條件下，轉(zhuǎn)TriAS基因擬南芥萌發(fā)率為86.67％、幼苗根長(zhǎng)增長(zhǎng)0.86cm均比野生型高，但其丙二醛含量和 SOD酶活性卻均低于野生型。對(duì)轉(zhuǎn)基因型擬南芥幼苗分別進(jìn)行鹽脅迫和干旱脅迫，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因擬南芥的生長(zhǎng)狀況優(yōu)于野生型；前者植株中丙二醛的含量遠(yuǎn)低于后者，而SOD酶的活性卻相反。鹽脅迫和干旱脅迫轉(zhuǎn)基因型和野生型煙草時(shí)，轉(zhuǎn)基因煙草的生長(zhǎng)狀況優(yōu)

6、于野生型；前者植株中丙二醛的含量和SOD酶活性均低于后者。
　　結(jié)論：從小黑麥中克隆出TriAS基因，編碼587個(gè)氨基酸，含有1個(gè)谷氨酰胺氨基轉(zhuǎn)移結(jié)構(gòu)域和1個(gè)天冬酰胺合成酶結(jié)構(gòu)域。鹽脅迫下小黑麥天冬酰胺合成酶基因表達(dá)量將會(huì)增加，在不同小黑麥品種和同一品種不同組織間該基因表達(dá)量增強(qiáng)程度不同。轉(zhuǎn)基因植株在抗逆性實(shí)驗(yàn)中生長(zhǎng)狀況優(yōu)于野生型，檢測(cè)到的生理指標(biāo)也證明了這一點(diǎn)?？梢?jiàn)，所克隆的小黑麥天冬酰胺合成酶基因促進(jìn)了擬南芥和煙草耐逆性能的提