土壤中枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）B908的分子檢測.pdf

1、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)B908是由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)提供的從江西水稻根際土壤中分離到的一株具有生防作用的野生菌株,該菌株對水稻紋枯病菌有較的強(qiáng)拮抗作用.經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明,對煙草、三七、花卉、小麥、白菜等作物的土壤病害也具有很好的防治效果.現(xiàn)已經(jīng)由云南農(nóng)大植物病理實(shí)驗(yàn)室、中國農(nóng)大植保學(xué)院生防室和云南省星耀生物制品廠,共同進(jìn)一步開發(fā)研究,主要有效成分為"枯草芽孢桿菌B908"的微生物農(nóng)藥產(chǎn)品"百抗".為了解B908在土壤中定

2、殖和消長動態(tài)的情況,該研究利用土壤回收DNA/PCR技術(shù)來檢測土壤中的微生物,初步建立起一套檢測土壤中B908的分子檢測體系.具體工作如下:1、使用RAPD、擴(kuò)增脂肽抗生素相關(guān)基因和AP-PCR 3種方法分析枯草芽孢桿菌與其他常見微生物之間的遺傳多樣性,從中尋找特異條帶.在所有嘗試中,只有從RAPD方法所獲得的多態(tài)性條帶中找到了一個特異條帶.回收此條帶,克隆測序.將測序結(jié)果在NCBI中用BLAST和FASTA工具進(jìn)行搜索,與現(xiàn)已知的基因

3、序列比較,沒有發(fā)現(xiàn)與此序列相似或同源性較高的其它序列.根據(jù)序列進(jìn)行SCAR引物的設(shè)計(jì),得到引物T1.用T1引物進(jìn)行PCR反應(yīng),在所有供試菌中,只有B908能擴(kuò)增出目的條帶,其余菌株無相同條帶或沒有擴(kuò)增產(chǎn)物.2、從土壤中提取微生物DNA的總量是分子檢測成功的關(guān)鍵之一,該文結(jié)合國內(nèi)普通實(shí)驗(yàn)的實(shí)際情況,分別選用兩種經(jīng)濟(jì)、簡單的裂解細(xì)胞方法(溶菌酶/SDS/凍融組合法,煮沸法)和DNA純化方法(氯仿/異戊醇,玻璃奶)提取土壤微生物的DNA總量,

4、并進(jìn)行比較分析和PCR擴(kuò)增檢測.結(jié)果表明,只有溶菌酶/SDS/凍融法獲得DNA后用玻璃奶純化法所獲得的DNA才能滿足PCR反應(yīng)的要求.用此方法提取不同類型土壤微生物的總DNA,并進(jìn)行比較,發(fā)現(xiàn)從沙土獲得的DNA量最大,溫室土和菜園土之間相差不明顯,且從不同類型土壤中獲得的微生物DNA都能滿足PCR反應(yīng)的要求.3、利用特異引物對接種有B908的土壤DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增,結(jié)果表明,只有在接有B908菌的土壤中,可以擴(kuò)增到目標(biāo)菌的DNA,其檢