枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）Bs-916胞外抗菌蛋白質(zhì)的純化及其鑒定.pdf

1、枯草芽孢桿菌Bs-916是我們自行分離的一株拮抗菌，目前用于防治水稻紋枯病和稻曲病，該菌株表現(xiàn)出廣譜的抑菌活性。本文研究了枯草芽孢桿菌Bs-916及分泌液對水稻紋枯病菌(Rhizoctonia solani)、蠶豆枯萎病菌(Fusarium oxysporum Schlecht. f. fabae Yu et Fang)、水稻惡苗病菌(Fusarium moniliforme Sheld.)、西瓜枯萎病菌 (Fusarium oxysp

2、orum(Schl.)f.sp.nieveum(E.F.Smith)Snyderet Hansen)、水稻稻瘟病菌 (Pyricularia grisea)、水稻稻曲病菌(Ustilaginoidea virens)、水稻白葉枯病菌 (Xanthomonas oryzae pv.oryzae(Ishiyama)Zoo)和水稻細菌性條斑病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzicola Dowson)的抑菌活性，發(fā)現(xiàn)枯草

3、芽孢桿菌Bs-916及其分泌物對上述病原菌均具有較強的抑菌活性，具有廣譜性的特點。同時，采用丙酮沉淀、PEG沉淀、等電點沉淀和超微濃縮，發(fā)現(xiàn)沉淀物和截留物都有抑菌活性，提示枯草芽孢桿菌胞外存在蛋白質(zhì)類抗菌物質(zhì)。 用硫酸銨分級沉淀枯草芽孢桿菌Bs-916胞外抗菌蛋白質(zhì)，共獲得8個蛋白質(zhì)粗提物，其中硫酸銨飽和度為40％～50％和50％～60％提取的粗蛋白質(zhì)具有較強的抑菌活性，說明該抗菌蛋白質(zhì)在硫酸銨飽和度為40-60％時就可完全沉淀

4、。研究結(jié)果表明：硫酸銨飽和度40％～50％和50％～60％提取的粗蛋白質(zhì)濃度分別為17.261μg/l和18.899μg/ml，上述兩者粗提物對水稻紋枯病菌和水稻惡苗病菌有較強的抑菌活性，對馬鈴薯晚疫病菌沒有抑菌活性：當(dāng)溫度高于40℃時抑菌活性均降低，但在120℃時仍有部分抑菌活性；對pH值適應(yīng)范圍較寬，在pH值為13.6時抑菌活性均喪失；經(jīng)蛋白酶K、蛋白酶E、胃蛋白酶、胰蛋白酶和木瓜蛋白酶處理后，抑菌活性均下降。SDS-PAGE電泳結(jié)

5、果表明枯草芽孢桿菌Bs-916能分泌多種蛋白質(zhì)。 采用了層析技術(shù)分離和純化了枯草芽孢桿菌Bs-916胞外的抗菌蛋白質(zhì)。利用 DEAE Sepharose Fast Flow柱層析，后獲得3個蛋白質(zhì)吸收峰，其中B峰具有抑菌活性，將B峰收集液過疏水層析柱Phenyl Sepharose 6 FF后獲得2個吸收峰，其中第E峰具有抑菌活性，再將第E峰收集液過羥基磷石灰石柱層析后得到了2個蛋白質(zhì)吸收峰，其中第G峰具有抑菌活性，經(jīng)SDS-P

6、AGE檢測后為單一的蛋白質(zhì)條帶(暫定名： Bacisubin)，該蛋白質(zhì)的分子量約為41.9kDa。研究了胞外抗菌蛋白質(zhì)(bacisubin)的抑菌活性。發(fā)現(xiàn)抗菌蛋白質(zhì)(Bacisubin)對水稻紋枯病菌(Rhizoctonia solani)、水稻稻瘟病菌(Magnaporthe grisease)、油菜菌核病菌(Sclerotinia sclerotiorum)、甘藍黑斑病菌(Alternaria oleraea)、白菜黑斑病菌病菌

7、(A.brassicae)、灰霉病菌(Botrytis cinerea)、辣椒炭疽病菌(C.capsici)和水稻惡苗病菌(F. moniliforme)均有抑菌活性。尤其對Alternaria屬的病原菌具有較高的毒力。結(jié)果顯示抗菌蛋白質(zhì)Bacisubin具有廣譜、高毒力的特點?？咕鞍踪|(zhì)(Bacisubin)對水稻紋枯病菌、灰霉病菌、甘藍黑斑病菌和白菜黑斑病菌的EC<,50>分別為4.011μM、2.740μM、0.087μM和0.0

8、55μM。枯草芽孢桿菌Bs-916胞外抗菌蛋白質(zhì)(Bacisubin)的抑菌機制是造成病原菌菌絲營養(yǎng)吸收困難，致使菌絲頂端膨大，分支增加，胞壁加厚、斷裂，從而抑制了病原菌的生長。同時該抗菌蛋白質(zhì)具有凝集素活性和核糖核酸酶活性。枯草芽孢桿菌Bs-916胞外抗菌蛋白質(zhì)(Bacisubin)無蛋白酶活性和蛋白酶抑制活性。 利用生物質(zhì)譜技術(shù)鑒定了枯草芽孢桿菌胞外抗菌蛋白質(zhì)。胞外抗菌蛋白質(zhì)(Bacisubin)經(jīng)過胰蛋白酶消解后，經(jīng)基質(zhì)協(xié)

9、助激光解吸附離子化-飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)獲得22個質(zhì)荷比峰(M/Z)，Matrix Science數(shù)據(jù)庫檢索未發(fā)現(xiàn)顯著相關(guān)的蛋白質(zhì)。再經(jīng)電噴霧四極桿飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜分析后(Q-TOF2)后獲得五個肽的氨基酸序列，氨基酸序列分別為VTIVDEKGR，F(xiàn)SDSDVMNR. VYIADSTNFK，ELPISENLASVNMR，EAEWAYMITGK。經(jīng)鑒定，該蛋白質(zhì)和一種枯草芽孢桿菌的草酸鹽脫羧酶和地衣芽孢桿菌的草酸鹽脫羧