仿刺參(Apostichopus japonicus，Selenka)體腔液中調理素樣分子的研究.pdf

1、仿刺參是我國遼寧、山東、河北等北方沿海省份重要的養(yǎng)殖經濟種類。仿刺參體腔液中的吞噬細胞在吞噬過程中起重要作用，而吞噬作用在無脊椎動物免疫防御中居于核心地位。調理素是一些血漿蛋白質，它們可以結合到病原體表面，使其成為靶細胞，為吞噬作用提供標記，從而增強吞噬細胞對病原體的吞噬作用。目前已在少數無脊椎動物中發(fā)現了調理素樣分子。為了探究仿刺參體腔液中是否存在調理素樣分子，且分析其調理素樣分子的的性質，采用熱致死酵母細胞作為吞噬實驗靶細胞。通過S

2、DS-PAGE，凝膠過濾層析，質譜分析，氨基酸序列分析等方法進行蛋白質的純化和分析；吞噬細胞對酵母細胞的吞噬作用研究采用熒光顯微鏡觀察。結果表明，仿刺參的吞噬細胞在等滲緩沖液、無細胞體腔液和酵母細胞作用的無細胞體腔液中均具有吞噬能力。在不同的反應基質條件下，吞噬細胞對酵母細胞的吞噬率有所不同。當反應基質為無細胞體腔液時，吞噬細胞對酵母細胞的吞噬率最高。SDS-PAGE分析結果表明，一種分子量約為18 kDa的分子可以結合到熱致死酵母細胞

3、上，增強吞噬作用。通過凝膠過濾層析純化出這種調理素樣分子。調理素樣分子功能檢測實驗表明，這種約18 kDa的調理素樣分子可增強吞噬細胞的吞噬作用，但其并不能單獨提高吞噬作用，還需要和體腔液中某種物質共同作用才可使吞噬作用得以增強。調理素樣分子N端前15個氨基酸序列及質譜分析結果表明，此調理素樣分子是無脊椎動物調理素樣分子中的新成員。 Western blots與ELISA分析結果均表明，脂多糖(LPS)免疫刺激和受傷均可使體腔

4、內調理素樣分子水平增加。注射LPS的仿刺參體腔液中調理素樣分子含量在注射后1h顯著增加(P＜0.05)。注射后1h到2d內顯著高于注射前15 min水平(P＜0.05)。最大量出現在注射后3d到6d，且顯著高于注射后1h到2d水平(P＜0.05)。6d后，調理素樣分子水平開始下降，并恢復到在注射后1h到2d水平(P＞0.05)。注無菌海水(SSW)的海參體內調理素樣分子水平較低。注射前15min到注射后12 h體腔液中調理素樣分子含量均

5、無顯著變化(P＞0.05)。注射后第2 d到8 d，調理素樣分子含量升高并顯著高于注射前15 min到注射后12 h水平(P＜0.05)。這是因為采取注射的方式，仿刺參會受傷，而受傷所產生的應激也可刺激機體產生免疫應答。 注射LPS的仿刺參體腔液中調理素樣分子水平除注射前15 min，注射后第2 d和8 d無顯著差異外(P＞0.05)，其它時間均顯著高于注射SSW組(P＜0.05)。這表明了LPS免疫刺激及受傷刺激均可使仿刺參體

6、內調理素樣分子含量增加。而受傷和LPS共同刺激可使機體分泌更多的調理素樣分子。 該調理素樣分子具凝集素性質，推測它是一種凝集素。該調理素樣分子可以凝集兔、雞、鼠、鯽和人的A、B、O、AB型紅細胞。其凝集結果為：雞＞兔＞人(A=B=O=AB)＞鼠＞鯽。凝菌結果表明，純化的調理素樣分子可凝集革蘭氏陽性細菌和革蘭氏陰性細菌。細菌中以鰻弧菌對調理素樣分子最敏感。在25-60℃保溫30 min，凝集活性均未見改變。在70℃30 min熱處

7、理后仍然對雞紅細胞顯示出凝集活性，活性開始下降。在80℃熱處理30 min后失去凝集活力。當5.0≤pH≤9.0時，仿刺參調理素樣分子具有活性，當pH為6.0-8.0時，活性最高，當pH為5.0或9.0時，活性下降，當pH≥10.0或≤4.0時，失去凝集活力。調理素樣分子不被所測試的D-葡萄糖(D-Glueose)、D-半乳糖(D-Galaetose)、L-Arabinose(L-巖藻糖)、D-木糖(D-Xylose)、D-甘露糖(D-

8、Mannose)、L-鼠李糖(L-Rhamnose)、D-果糖(D-Frutose)和LPS所抑制?？杀籒-乙酰葡萄糖胺(GlcNAc)、N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)、N-乙酰神經氨酸(NeuAc)、牛下顎粘液素(Bovine submaxillary mucin，BSM)、胎球蛋白(Fetuin)、脫唾液酸牛下顎粘液素(Asialo-BSM)、脫唾液酸胎球蛋白(Asialo-Fetuin)所抑制。N-乙酰葡萄糖胺(GlcNAc)、

9、N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)和N-乙酰神經氨酸(NeuAc)的最小抑制濃度分別為20.15 mmol/L、12.50 mmol/L和0.25mmol/L。牛下顎粘液素(Bovine submaxillary mucin，BSM)、胎球蛋白(Fetuin)、脫唾液酸牛下顎粘液素(Asialo-BSM)、脫唾液酸胎球蛋白(Asialo-Fetuin)的最小抑制濃度分別為0.39 mg/mL、1.56 mg/mL、3.12 mg/mL和6