重組刺參(Apostichopus japonicus)凝集素的表達與活性分析.pdf

1、海參（Sea Cucumber）是我國重要的海水養(yǎng)殖物種，具有重要的經濟價值。由于海參的營養(yǎng)價值和藥用價值，海參產業(yè)在亞洲國家迅猛發(fā)展。然而，海參很容易被多種細菌、寄生蟲和病毒感染，例如，細菌感染導致的腐皮綜合征會引起海參體壁肌肉潰瘍、唇腫脹、自溶甚至是死亡，這嚴重制約了海參養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。目前，針對病害問題采用的藥物治療方法，不僅容易使海參產生抗藥性，而且還會破壞水質，影響生態(tài)環(huán)境；采用生物防治的方法，開發(fā)海參綠色制劑是大勢所趨。凝集素

2、是一類具有識別特殊碳鏈基團的蛋白質，具有抗病毒、抗真菌和抗腫瘤等多種優(yōu)點，在海參的先天免疫中發(fā)揮重要作用，具有廣闊的應用前景。
　　本文以刺參（Apostichopus japonicus）體壁總RNA為模板，應用cDNA末端快速擴增技術（RACE）克隆出兩個新型C型凝集素基因（C-type lectins）AjL和AjMBCL，通過原核表達技術獲得凝集素融合蛋白，并鑒定融合蛋白活性?？寺〉玫降腁jL基因CDS為492bp，編碼1

3、63個氨基酸，其中，氨基酸序列1～20為信號肽區(qū)域，成熟肽區(qū)由143個氨基酸組成，理論蛋白分子質量為17705.7道爾頓，等電點為4.48；AjMBCL基因的CDS為537bp，編碼178個氨基酸，其中，1～21位為信號肽區(qū)，22～178位氨基酸序列組成成熟肽區(qū)域，AjMBCL的理論蛋白分子量為19880.2道爾頓，等電點為6.98。通過氨基酸序列分析、多重序列比對和進化樹構建等生物信息學分析結果表明，成功克隆到刺參凝集素基因AjL和A

4、jMBCL。本實驗的原核表達采用大腸桿菌BL21（DE3）表達體系，應用PCR技術擴增出凝集素基因AjL和AjMBCL的開放閱讀框片段，將目的基因連接到pET-32a(+)載體并構建重組子pET-32a-AjL和pET-32a-AjMBCL；將重組子轉化至大腸桿菌中，37℃，培養(yǎng)菌至OD600到0.45-0.6之間，28℃，IPTG（0.5mM/mL）緩慢誘導過夜；誘導表達的融合蛋白AjL分子量為34KDa左右，AjMBCL融合蛋白表達

5、的分子量為30KDa左右。融合蛋白的純化采用鎳離子親和層析方法，其原理是帶組氨酸標簽的融合蛋白與鎳離子具有較高親和力，用高濃度的咪唑可競爭洗脫出目的融合蛋白，該方法簡單、高效、純化效果好，適用于工業(yè)化生產。凝集素的顯著特性就是能夠凝集紅細胞，本研究將處理好的紅細胞懸液與純化的融合蛋白在室溫下混勻，結果發(fā)現紅細胞出現聚集且不能被吹散，說明本實驗表達的融合蛋白 AjL和 AjMBCL具有凝血活性，最低凝集濃度分別為0.085mg/ml和0.