海濱錦葵莖尖再生體系建立及GPD1和DGAT植物表達(dá)載體構(gòu)建.pdf

1、為了提高海濱錦葵含油量,促進(jìn)生物柴油產(chǎn)業(yè)發(fā)展,緩解能源危機(jī)給全球帶來的壓力,本實(shí)驗(yàn)以海濱錦葵莖尖為外植體,對(duì)海濱錦葵組織培養(yǎng)進(jìn)行優(yōu)化,建立了良好的高頻的植株再生體系。并構(gòu)建了高效的高含油量種子特異啟動(dòng)子napin驅(qū)動(dòng)的GPD1和DGAT植物表達(dá)載體。為今后建立高頻、高效海濱錦葵再生體系,利用轉(zhuǎn)基因方法培育優(yōu)良的、高含油量的海濱錦葵新品系提供一些參考數(shù)據(jù)。
　　 以下為本研究主要進(jìn)行的工作和取得的主要結(jié)論:
　　 1.用9

2、8％的濃硫酸浸泡海濱錦葵種子1h左右,無菌水將表面濃硫酸沖洗干凈,無菌水浸泡10h以上至種子露白,剝?nèi)シN皮后接種到培養(yǎng)基上以獲取無菌苗。取3日苗齡的無菌苗,用鑷子和解剖刀將莖頂生長(zhǎng)點(diǎn)除去,切取0.5～1.0mm莖尖分生組織接種到培養(yǎng)基上。培養(yǎng)溫度為(26±1)℃；相對(duì)濕度為70％～80％；光照時(shí)間為14h/d；光照強(qiáng)度為20001x。以MS(蔗糖3％、瓊脂0.8％、pH值5.8)培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基。海濱錦葵莖尖萌發(fā)最適培養(yǎng)基為MS+IA

3、A0.3mg/L+ZT0.3mg/L,萌發(fā)率為91.11％；增殖最適培養(yǎng)基為MS+IAA0.1mg/L+KT0.5mg/L,增殖系數(shù)為4.67；生根培養(yǎng)基為MS(蔗糖3％、瓊脂0.6％、pH值5.8),生根率為90％。煉苗移栽后,成活率可達(dá)60％。
　　 2.利用PCR擴(kuò)增的技術(shù)從酵母INVScl(Saccharomyces cerevisiae)、甘藍(lán)型油菜(Brassica napus.L.)的基因組DNA和擬南芥(Arab

4、idopsis thaliana)cDNA中分別擴(kuò)增獲得3-磷酸甘油脫氫酶(GPD1)、種子特異啟動(dòng)子napin和二脂酰甘油?；D(zhuǎn)移酶(DGAT)的基因片段,并將它們分別克隆到pMD18-T(克隆載體)之中。利用pBluescriptKS(中間克隆載體)將napin和GPD1兩目的基因片段插入到pCAMBIA1390(植物表達(dá)載體)的多克隆位點(diǎn)處,構(gòu)建了種子特異啟動(dòng)子napin驅(qū)動(dòng)的GPD1基因植物表達(dá)載體p1390NG。將napin和

5、DGAT兩目的基因片段依次插入到pCAMBIA1390(植物表達(dá)載體)的多克隆位點(diǎn)處,構(gòu)建了種子特異啟動(dòng)子napin驅(qū)動(dòng)的DGAT基因植物表達(dá)載體p1390ND,并分別利用凍融法將p1390NG和p1390ND兩植物表達(dá)載體導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)LBA4404、EHA105、AGL1中,本實(shí)驗(yàn)室正在進(jìn)行抗逆能源植物海濱錦葵(Kosteletzkya virginica)和曼陀羅(Datura