家蠶黑色素合成途徑基因的分子進(jìn)化.pdf

1、家蠶在大約5000年前由中國(guó)野桑蠶馴化而來(lái),長(zhǎng)期的人工選擇使家蠶的體色發(fā)生了不同于野桑蠶的顯著變化。迄今為止,家蠶和野桑蠶之間體色差異的分子機(jī)制尚不清楚。隨著家蠶基因組框架圖、精細(xì)圖和重要遺傳資源重測(cè)序的相繼完成,數(shù)以十萬(wàn)計(jì)的EST以及基因全長(zhǎng)cDNA序列的陸續(xù)公布,為從分子水平上解析馴化選擇對(duì)家蠶特定生物學(xué)性狀形成的作用,闡釋家蠶和野桑蠶之間生物學(xué)差異的遺傳基礎(chǔ)提供了可能。本研究首先通過(guò)對(duì)家蠶和野桑蠶體色差異進(jìn)行比較,并使用透射電鏡分

2、析體壁超微結(jié)構(gòu)的差異;其次,由于昆蟲的黑色素主要通過(guò)黑色素合成途徑產(chǎn)生,本研究利用生物信息學(xué)分析方法對(duì)家蠶基因組中的黑色素合成途徑基因進(jìn)行鑒定,并分析了各基因的時(shí)空表達(dá)模式;然后,以家蠶黑色素合成途徑基因?yàn)闃?biāo)記,通過(guò)克隆測(cè)序分析,比較了家蠶和野桑蠶種內(nèi)核苷酸多態(tài)性和種間分歧度,探索了基因核苷酸多態(tài)性與基因在代謝途徑位置之間的關(guān)系;最后,通過(guò)中性檢驗(yàn)、溯祖模擬分析、連鎖不平衡分析、系統(tǒng)發(fā)生分析、單倍型網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)分析以及實(shí)時(shí)定量PCR等,探測(cè)

3、家蠶黑色素合成途徑基因是否有人工選擇的印記,并對(duì)人工選擇的靶基因進(jìn)行了鑒定,進(jìn)而對(duì)人工選擇的分子機(jī)制進(jìn)行了推測(cè)。主要研究結(jié)果如下:
　　 1.家蠶和野桑蠶的體色比較及體壁超微結(jié)構(gòu)分析
　　 無(wú)論是幼蟲期、蛹期還是成蟲期,家蠶體色與野桑蠶體色都存在顯著的差異。家蠶幼蟲除了眼狀紋、半月紋及星狀紋區(qū)域?yàn)楹谏?表皮的其他區(qū)域呈現(xiàn)出比較均一的白色。而相對(duì)于家蠶,野桑蠶五齡幼蟲眼狀紋、半月紋、星狀紋以及尾角區(qū)域?yàn)槌嗪稚?表皮的大部

4、分區(qū)域呈現(xiàn)出黑體色,也有小部分區(qū)域呈淺褐色。家蠶蛹體表為淺黃色,而野桑蠶的表皮呈現(xiàn)顏色較深的棕褐色。家蠶成蟲為白體色,而野桑蠶全身呈現(xiàn)黑褐色,翅有黑色翅斑。
　　 透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn),家蠶和野桑蠶體壁超微結(jié)構(gòu)主要存在兩個(gè)方面的差異:一是真皮層白色尿酸顆粒的數(shù)量不同,野桑查真皮層只有少量的白色尿酸顆粒,而家蠶真皮層含有大量白色尿酸顆粒;二是表皮外層不規(guī)則黑色素顆粒的有無(wú),野桑蠶表皮外層含有大量黑色素顆粒,而家蠶的表皮外層沒(méi)有黑色素顆

5、粒的存在。
　　 綜合分析以上結(jié)果,可以得出,野桑蠶的體色為較深的黑色或褐色,而家蠶的體色呈現(xiàn)出白色或淺黃色;體壁超微結(jié)構(gòu)分析結(jié)果能很好地闡釋了家蠶和野桑蠶體色差異的物質(zhì)基礎(chǔ),家蠶之所以呈現(xiàn)白體色,是因?yàn)檎嫫雍写罅堪咨蛩犷w粒;而野桑蠶的黑體色主要是由表皮外層沉積的大量黑色素導(dǎo)致。由此可見(jiàn),馴化過(guò)程中家蠶體色的改變很可能與黑色素的合成差異相關(guān),而昆蟲中黑色素的合成主要通過(guò)黑色素合成途徑來(lái)完成。
　　 2.家蠶黑色素合

6、成途徑基因的鑒定和表達(dá)模式分析
　　 參照黑腹果蠅黑色素合成途徑9個(gè)基因的氨基酸序列,通過(guò)同源性比對(duì),我們發(fā)現(xiàn),家蠶基因組中都能搜尋到各自的同源基因,分別位于第1、第4、第8、第11、第13以及第26號(hào)染色體,但其中的yellow-f和yellow-f2兩個(gè)基因?qū)?yīng)了家蠶的同一個(gè)預(yù)測(cè)基因BGIBMGA014224。進(jìn)一步分析基因結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn),所有的基因都由多個(gè)外顯子構(gòu)成。
　　 黑色素合成途徑基因在家蠶五齡三天各組織中的表達(dá)

7、模式分析發(fā)現(xiàn),酪氨酸羥化酶基因TH主要在家蠶的頭、表皮、脂肪體和氣管中表達(dá);多巴脫羧酶基因Ddc主要在家蠶的頭、表皮、脂肪體、氣管和生殖腺中表達(dá);yellow和yellow-f基因主要在家蠶的頭、表皮、絲腺和氣管中表達(dá);black和ebony基因主要集中在家蠶的頭部表達(dá);Dat1基因集中在家蠶的頭、表皮、絲腺和脂肪體中表達(dá),其次在中腸和氣管中也有微量表達(dá);tan基因在所分析的8個(gè)組織中都有表達(dá),其中在脂肪體中表達(dá)較低。
　　 利

8、用RT-PCR試驗(yàn)分析了黑色素合成途徑基因在家蠶不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)特征,結(jié)果表明,TH基因在家蠶幼蟲、蛹及成蟲各個(gè)發(fā)育階段都有表達(dá),其中蛻皮期表達(dá)量最高;Ddc基因的表達(dá)整體水平較低,但表達(dá)高峰仍然在蛻皮期;yellow基因表達(dá)量最高的時(shí)期也分布于一齡眠、二齡眠、三齡眠及四齡眠等蛻皮期;yellow-f基因與TH基因的表達(dá)模式相似,蛻皮期表達(dá)量最高,蛻皮后的初期表達(dá)量開(kāi)始下降,而盛食期到蛻皮前這段時(shí)間基因表達(dá)量較低;black基因與ye

9、llow基因相似,在一齡眠、二齡眠、三齡眠及四齡眠等蛻皮期表達(dá)量最高,其他時(shí)期表達(dá)量較低;Dat1基因在幼蟲一齡到四齡的盛食期表達(dá)量很低,而從五齡四天到化蛹以及蛾期表達(dá)量都較高,同時(shí),蛻皮期表達(dá)量也較高;ebony基因的表達(dá)主要集中在蛻皮期及蛻皮后的初期,還有就是蛹期和蛾期也有較高的表達(dá)水平,其余時(shí)期表達(dá)很微弱;tan基因在家蠶幼蟲、蛹及成蟲各個(gè)發(fā)育階段都有表達(dá),而且時(shí)期表達(dá)差異不明顯。
　　 綜合分析以上結(jié)果,本研究成功鑒定了

10、家蠶黑色素合成途徑基因,并對(duì)其時(shí)空表達(dá)模式進(jìn)行了分析。組織表達(dá)譜分析的結(jié)果表明,黑色素合成途徑基因主要在家蠶頭和表皮中高量表達(dá),與家蠶黑色素主要分布于頭和表皮相一致。時(shí)期表達(dá)譜分析的結(jié)果表明,黑色素合成途徑基因表達(dá)高峰主要分布在蛻皮期,反映了家蠶黑色素的合成主要發(fā)生在蛻皮期間,同時(shí)也說(shuō)明了黑色素合成途徑基因可能與家蠶表皮的鞣化也緊密相關(guān)。這暗示了黑色素合成途徑基因在家蠶馴化過(guò)程中并沒(méi)有喪失功能。
　　 3.家蠶和野桑蠶黑色素合成

11、途徑基因核苷酸多態(tài)性分析
　　 本研究共測(cè)序了8個(gè)家蠶黑色素合成途徑基因,每個(gè)基因包括30個(gè)樣本(15個(gè)家蠶樣本和15個(gè)野桑蠶樣本)。基于全序列的家蠶核苷酸多態(tài)性(πtotal)分析發(fā)現(xiàn),black基因的多態(tài)性最低,πtotal值為0.00031,而tan基因的多態(tài)性最高,πtotal值等于0.02891,家蠶黑色素合成途徑8個(gè)基因的核苷酸多態(tài)性平均值為0.01340。相對(duì)于家蠶,基于全序列的野桑蠶黑色素合成途徑基因的核苷酸多態(tài)

12、性如下,TH基因的多態(tài)性最低,πtotal值為0.00977,而tan基因的多態(tài)性最高,πtotal值為0.03496,8個(gè)基因的核苷酸多態(tài)性平均值為0.02261。利用威爾科克森符號(hào)秩檢驗(yàn)(Wilcoxon signed rank test)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果表明,野桑蠶黑色素合成途徑基因的核苷酸多態(tài)性顯著高于家蠶黑色素合成途徑基因的核苷酸多態(tài)性(P=0.01,df=7),40.7％的野桑蠶核苷酸多態(tài)性在家蠶中發(fā)生了丟失。如果基于群體多

13、態(tài)性參數(shù)θw來(lái)進(jìn)行分析,也可以得到相似的結(jié)果:家蠶中black基因的θw值最低(0.00069),tan基因的θw值最高(0.02885),8個(gè)黑色素合成途徑基因的平均值為0.01337;而野桑蠶中TH基因的θw值最低(0.01245),tan基因的θw值最高(0.04157),8個(gè)黑色素合成途徑基因的平均值為0.02633。利用威爾科克森符號(hào)秩檢驗(yàn)(Wilcoxon signed rank test)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果表明,野桑蠶黑色素

14、合成途徑基因的核苷酸多態(tài)性顯著高于家蠶黑色素合成途徑基因的核苷酸多態(tài)性(P=0.01,df=7),49.2％的野桑蠶核苷酸多態(tài)性在家蠶中發(fā)生了丟失。
　　 黑色素合成途徑8個(gè)基因可以分為兩組:TH和black基因編碼黑色素代謝途徑最初的兩個(gè)酶,分別將酪氨酸和尿嘧啶加工成黑色素前體,而Ddc、yellow、yellow-f、Dat1、ebony以及tan基因?yàn)榇x途徑的下游基因。為了研究基因核苷酸多態(tài)性與基因在代謝途徑位置的關(guān)系,

15、我們對(duì)核苷酸多態(tài)性的高低是否受基因在代謝途徑位置影響進(jìn)行了評(píng)估。家蠶黑色素合成途徑上游基因TH和black的核苷酸多態(tài)性的平均值為0.00064,而下游基因的核苷酸多態(tài)性的平均值為0.01765。利用t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn),家蠶黑色素合成途徑上游基因的核苷酸顯著低于下游基因(Student's t-test,P=0.0310,df=6)。野桑蠻群體也有相似的結(jié)果:野桑蠶黑色素合成途徑上游基因TH和black的核苷酸多態(tài)性的平均值為0.0

16、1273,而下游基因核苷酸多態(tài)性的平均值為0.02590,利用t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn),野桑蠶黑色素合成途徑上游基因的核苷酸也顯著低于下游基因(Student's t-test,P=0.0207,df=6)。這表明黑色素合成途徑的位置的確影響了選擇壓力的分布,即上游基因比下游基因受到了更高水平的選擇壓力。
　　 中性檢驗(yàn)的結(jié)果表明,4個(gè)家蠶黑色素合成途徑基因(TH、black、ebony以及yellow)和7個(gè)野桑蠶黑色素合成途徑

17、基因(TH、black、Ddc、Dat1、tan、yellow以及yellow-f)的Taijma's D值小于0,另外,3個(gè)家蠶黑色素合成途徑基因(TH、black以及yellow)和7個(gè)野桑蠶黑色素合成途徑基因(TH、black、Ddc、Dat1、tan、yellow以及yellow-f)的Fu and Li's D值小于0,這表明,家蠶和野桑蠶都可能經(jīng)歷了定向選擇的作用。我們還可以發(fā)現(xiàn),4個(gè)家蠶黑色素合成途徑基因(Ddc、Dat1

18、、tan以及yellow-f)和1個(gè)野桑蠶黑色素合成途徑基因(ebony)的Taiima's D值大于0,另外,5個(gè)家蠶黑色素合成途徑基因(Ddc、Dat1、tan、ebony以及yellow-f)和1個(gè)野桑蠶黑色素合成途徑基因(ebony)的Fu and Li's D值大于0,這表明中等頻率的等位基因過(guò)量,可能是由于群體的瓶頸效應(yīng)、群體收縮或者是平衡選擇導(dǎo)致。無(wú)論是在家蠶群體,還是野桑蠶群體,所有黑色素合成途徑基因Fay and Wu

19、'sH檢驗(yàn)都不顯著,這表明各基因都不存在由于搭載效應(yīng)引起的高頻率的等位基因過(guò)量。
　　 家蠶和野桑蠶黑色素合成途徑8個(gè)基因的連鎖不平衡分析結(jié)果顯示,家蠶和野桑蠶黑色素合成途徑基因的連鎖不平衡曲線在200 bp內(nèi)呈快速降低趨勢(shì),而在200 bp以上的距離連鎖不平衡曲線降低極為緩慢;野桑蠶黑色素合成途徑基因的r2值在200 bp內(nèi)快速降低至0.22,并在1600 bp內(nèi)降低至0.10,而家蠶黑色素合成途徑基因的r2值在200 bp內(nèi)

20、快速降低至0.54,并始終大于0.40?？傊?家蠶黑色素合成途徑基因的連鎖不平衡程度要高于野桑蠶,表明家蠶由于馴化的影響,黑色素合成途徑基因的重組率低于野桑蠶。
　　 4.家蠶馴化過(guò)程中TH基因受到人工選擇的證據(jù)
　　 綜合本研究的結(jié)果,我們可以發(fā)現(xiàn),TH基因的確是家蠶馴化過(guò)程中人工選擇的靶基因,其主要證據(jù)如下:首先,與野桑蠶相比,家蠶TH基因的核苷酸多態(tài)性降低了90％,序列分析的結(jié)果也顯示,在野桑蠶大多數(shù)多態(tài)性位點(diǎn)處,

21、家蠶不呈現(xiàn)多態(tài)性,而且是其中的一種野桑蠶單倍型在家蠶中得到了固定;其次,中性檢驗(yàn)的結(jié)果表明,無(wú)論Tajima's D值還是Fu and Li's D值都小于0,統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)也都表明家蠶TH基因顯著偏離中性進(jìn)化的模型,這意味著TH基因可能受到了定向選擇的作用或者發(fā)生了群體擴(kuò)張;第三,溯祖模擬的結(jié)果也表明,家蠶TH基因顯著偏離瓶頸效應(yīng)的模型,可能是馴化選擇的靶基因;第四,TH基因的單倍型網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)與系統(tǒng)發(fā)生分析結(jié)果表明,所有的家蠶樣本能聚類在一起

22、形成一個(gè)單獨(dú)的cluster,而與野桑蠶樣本明顯地區(qū)分開(kāi)來(lái);第五,研究結(jié)果證明家蠶TH基因的核苷酸多態(tài)性的降低并非由瓶頸效應(yīng)導(dǎo)致;第六,Fay and Wu's H檢驗(yàn)以及TH基因連鎖區(qū)域多態(tài)性比較等結(jié)果表明,家蠶TH基因并沒(méi)有受到搭載效應(yīng)的影響。因此,人工選擇作用于TH基因,而不是其連鎖區(qū)域。
　　 進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn),家蠶和野桑蠶TH基因多態(tài)性差異區(qū)段主要位于非編碼區(qū),尤其是內(nèi)含子區(qū)域,而側(cè)翼區(qū)以及CDS區(qū)域,多態(tài)性差異相對(duì)較小

23、。共發(fā)現(xiàn)4個(gè)種間固定位點(diǎn),前兩個(gè)固定位點(diǎn)位于第一內(nèi)含子,第三固定位點(diǎn)位于第二內(nèi)含子,最后一個(gè)固定位點(diǎn)位于外顯子上,但密碼子CCA突變成密碼子CCG并沒(méi)有造成氨基酸的改變,堿基突變屬于同義替換。轉(zhuǎn)錄因子識(shí)別位點(diǎn)預(yù)測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn),野桑蠶群體中第一個(gè)固定位點(diǎn)存在一個(gè)Abd-B及同源HOX蛋白的識(shí)別位點(diǎn)(TTTAT),而在家蠶群體中,全部突變成了TTTAA;在第二個(gè)固定位點(diǎn)處,野桑蠶群體具有視黃醇類X受體(RXR)異源二聚體結(jié)合位點(diǎn)核心序列GGTC

24、,但在家蠶群體中突變成了GGCC而喪失結(jié)合能力;但是,在第三個(gè)固定位點(diǎn)處,盡管堿基由野桑蠶中的C突變成家蠶中的G,并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)附近有轉(zhuǎn)錄因子識(shí)別位點(diǎn)的獲得與丟失。迄今為止,尚未有RXR異源二聚體結(jié)合位點(diǎn)與昆蟲體色形成相關(guān)聯(lián)的研究報(bào)道,因此,我們重點(diǎn)關(guān)注了第一個(gè)固定位點(diǎn)處轉(zhuǎn)錄因子識(shí)別位點(diǎn)的變化。
　　 為了進(jìn)一步鑒定家蠶馴化過(guò)程中TH基因第一內(nèi)含子Abd-B識(shí)別位點(diǎn)是否真正發(fā)生了突變,我們擴(kuò)大了家蠶和野桑蠶的群體。我們對(duì)另外的60個(gè)

25、家蠶樣本和7個(gè)野桑蠶樣本TH基因第一內(nèi)含子Abd-B識(shí)別位點(diǎn)區(qū)段進(jìn)行了克隆測(cè)序,測(cè)序結(jié)果表明所有的野桑蠶樣本都含有Abd-B識(shí)別位點(diǎn)TTTAT,而所有家蠶樣本中該基序都突變成了TTTAA。
　　 先前的研究表明,Abd-B能通過(guò)與識(shí)別位點(diǎn)(TTTAT或TTTAC)相結(jié)合,增強(qiáng)yellow基因的表達(dá),進(jìn)而促進(jìn)雄果蠅第5和第6腹節(jié)黑色素的生成,相反,Abd-B識(shí)別位點(diǎn)的突變失活會(huì)直接導(dǎo)致雄果蠅第5和第6腹節(jié)黑體色性狀的丟失。因此,本

26、研究通過(guò)熒光定量PCR分析家蠶和野桑蠶3個(gè)主要發(fā)育時(shí)期(幼蟲、蛹及成蟲)TH基因的相對(duì)表達(dá)量,結(jié)果表明,無(wú)論是幼蟲、蛹還是成蟲期,家蠶TH基因的相對(duì)表達(dá)量都要顯著低于野桑蠶(Student's t-test,P<0.0001),這與家蠶相對(duì)于野桑蠶呈現(xiàn)的淺體色是完全一致的。而酪氨酸羥化酶(TH)是昆蟲黑色素合成途徑的限速酶,其活性的強(qiáng)弱直接影響昆蟲的體色。
　　 綜上所述,我們推測(cè),TH基因第一內(nèi)含子中一個(gè)可能的增強(qiáng)子元件(Ab