正交設(shè)計(jì)法優(yōu)選蒲桃中總黃酮的提取工藝研究

1、<p><b>　　本科畢業(yè)論文</b></p><p>　　正交設(shè)計(jì)法優(yōu)選蒲桃中總黃酮的提取工藝研究</p><p>　二級(jí)學(xué)院中藥學(xué)院</p><p>　專 業(yè)中藥學(xué)（中藥分析鑒定方向）</p><p>　班 級(jí)2011級(jí)（3）班</p><p>　學(xué)生姓名馮珊娜<

2、/p><p>　學(xué) 號(hào)1106503304</p><p>　指導(dǎo)教師何洋</p><p>　2015年 4 月</p><p><b>　　誠(chéng) 信 聲 明</b></p><p>　　我聲明，所呈交的畢業(yè)論文（設(shè)計(jì)）是本人在老師指導(dǎo)下進(jìn)行的研究工作及取得的研究成果。據(jù)我查證，除了文中特別加以標(biāo)

3、注和致謝的地方外，論文（設(shè)計(jì)）中不包含其他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果，也不包含為獲得其他教育機(jī)構(gòu)的學(xué)位或證書而使用過的材料。我承諾，論文（設(shè)計(jì)）中的所有內(nèi)容均真實(shí)、可信。</p><p>　　畢業(yè)論文（設(shè)計(jì)）作者（簽名）： </p><p>　　年 月 日</p><p><b>　　目 錄</b>

4、</p><p><b>　　摘要Ⅰ-Ⅱ</b></p><p><b>　　1前言1</b></p><p><b>　　2儀器與材料3</b></p><p><b>　　2.1儀器3</b></p><p>　　2.2

5、 藥材與試劑3</p><p><b>　　3 方法4</b></p><p>　　3.1 蒲桃總黃酮含量測(cè)定方法4</p><p>　　3.2 方法學(xué)考察4</p><p>　　3.3 單因素考察方法5</p><p>　　3.4 蒲桃中總黃酮提取的正交試驗(yàn)6</p>

6、<p><b>　　4結(jié)果6</b></p><p>　　4.1方法學(xué)考察結(jié)果6</p><p>　　4.2單因素考察結(jié)果9</p><p>　　4.3蒲桃總黃酮提取的正交試驗(yàn)優(yōu)選結(jié)果12</p><p><b>　　5討論13</b></p><p>　

7、　5.1最大吸收波長(zhǎng)的選擇：13</p><p>　　5.2提取條件影響程度分析13</p><p>　　5.3顯色反應(yīng)分析14</p><p><b>　　6結(jié)論14</b></p><p><b>　　參考文獻(xiàn)15</b></p><p><b>　　

8、綜述17</b></p><p><b>　　致謝24</b></p><p>　　正交設(shè)計(jì)法優(yōu)選蒲桃中總黃酮的提取工藝研究</p><p>　　摘要：目的 利用正交設(shè)計(jì)法優(yōu)選蒲桃中總黃酮的提取工藝。方法 以蘆丁為對(duì)照品，以亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉為顯色劑，用紫外分光光度法在510nm波長(zhǎng)處測(cè)定總黃酮的含量。采用L9(34)正

9、交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，以蒲桃中總黃酮含量為考察指標(biāo)，考察乙醇濃度、提取時(shí)間、料液比、提取溫度4個(gè)因素對(duì)蒲桃中總黃酮的提取的影響。結(jié)果 蒲桃中總黃酮的最佳提取工藝為60%乙醇，70倍量，80℃，回流提取2h。結(jié)論 經(jīng)試驗(yàn)證明，該提取工藝重復(fù)性好，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，易于操作，便于推廣，對(duì)進(jìn)一步的工藝開發(fā)和蒲桃中總黃酮的研究有較好的參考價(jià)值。</p><p>　　關(guān)鍵詞：蒲桃；總黃酮；正交實(shí)驗(yàn)；紫外-可見分光光度法</p>

10、;<p>　　Study on Extraction Technology of Total Flavonoids in Syzygium jambos (L.) Alston by Orthogonal Design</p><p>　　Abstract: Objective To optimize extraction technology of total flavonoids in Syzy

11、gium jambos (L.) Alston. Methods The ultraviolet spectrophotometry method was used to measure the total flavonoids content in ethanol extract of Syzygium jambos (L.) Alston with different polar solvent extraction, with s

12、odium nitrite-aluminum nitrate-sodium hydroxide as color reagent and the rutin as standard substance and the maximum absorption wave-length of 510nm. By L9(34) orthogonal experimental design, with Sy</p><p>

13、　　Key words: Syzygium jambos (L.) Alston; total flavonoids; orthogonal experiment; UV-Vis spectrophotometry </p><p><b>　　1 前言</b></p><p>　　蒲桃(Syzygium jambos (L.) Alston)為桃金娘科蒲桃屬常綠喬木

14、[1]，收載于《廣東省中藥材標(biāo)準(zhǔn)》(第一冊(cè))，又有名稱為水蒲桃、響鼓、鈴鐺果、風(fēng)鼓和香果等，有此名稱，是因?yàn)槠涔麑?shí)到成熟季節(jié)，會(huì)散發(fā)如玫瑰般的清新香味，同時(shí)果核可在果腔內(nèi)隨意滾動(dòng)，搖動(dòng)起來有響聲。蒲桃原產(chǎn)于馬來群島、印度及我國(guó)的海南省，集中分布在亞洲熱帶地區(qū)，也有分布在亞洲亞熱帶至溫帶，以及大洋洲的部分地區(qū)。蒲桃在我國(guó)現(xiàn)在主要分布于海南、臺(tái)灣、廣東、廣西、福建、云南和貴州等地區(qū)，大半處于半野生狀態(tài)[2]。蒲桃多生長(zhǎng)在陰濕之地，喜光喜陰，

15、喜溫暖濕潤(rùn)的氣候，因此常生長(zhǎng)在小溪邊或者低濕的溝谷里；耐肥沃耐澇，不耐貧瘠干旱，因此濕潤(rùn)且肥沃的土壤較適宜其生長(zhǎng)。蒲桃作用繁多，來源廣泛，資源甚多，且價(jià)廉易得。蒲桃的根系發(fā)達(dá)，且生長(zhǎng)情況較好，因此具備強(qiáng)抗風(fēng)性，同時(shí)還具有抗二氧化硫、抗氯氣、抗機(jī)動(dòng)車尾氣、抗粉塵等功能，常用于園林綠化、防護(hù)植物。民間有將其采摘鮮食，有將其用于釀酒，有將其曬干制成涼茶。而在藥用方面，其作用也是不容小覷的，蒲桃的藥用部位包括葉、干燥莖、種子、花和果實(shí)。據(jù)相關(guān)資

16、料研究記載，蒲桃葉和花搗爛可以用來</p><p>　　黃酮類化合物是廣泛存在于自然界的一大類天然有機(jī)化合物，是植物在長(zhǎng)期自然選擇過程中產(chǎn)生的一類次生代謝產(chǎn)物，是在體內(nèi)主要由莽草酸途徑和乙酸-丙二酸途徑生物合成的一類產(chǎn)物。目前，黃酮類化合物泛指兩個(gè)苯環(huán)通過三個(gè)碳原子相互聯(lián)結(jié)形成的一系列化合物，它分布廣泛，主要存在于高等植物及羊齒植物的根、莖、葉、花、果實(shí)等中，其中以被子植物分布最多。黃酮類化合物在植物體內(nèi)大半以與

17、糖結(jié)合成為苷類的形式存在，少部分以游離形式存在。黃酮類化合物具有許多重要的生理、生化作用——清除生物體內(nèi)的自由基，具有抗氧化作用[12]，具有抗腫瘤、調(diào)血脂、抑制血小板聚集、抗動(dòng)脈粥樣硬化、抗骨質(zhì)疏松等各種作用[13-16]。黃酮類化合物的這些生理活性在抗衰老和預(yù)防治療人類的腫瘤、心血管病等疾病這些方面具備重要意義。</p><p>　　正交設(shè)計(jì)法是研究多因素多水平的一種設(shè)計(jì)方法，是試驗(yàn)優(yōu)化的一種常用技術(shù)。正交設(shè)

18、計(jì)法建立在概率論、數(shù)量統(tǒng)計(jì)之上，運(yùn)用排列整齊的正交表安排試驗(yàn)方案，再經(jīng)過綜合比較和對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的統(tǒng)計(jì)分析，達(dá)到減少試驗(yàn)次數(shù)而能快速獲得最優(yōu)試驗(yàn)方案的目的。正交設(shè)計(jì)法設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單可行，數(shù)據(jù)點(diǎn)分布均勻，可減少不必要的人力物力財(cái)力等資源的浪費(fèi)，在現(xiàn)代制備工藝和提取工藝的研究中應(yīng)用廣泛[17]。</p><p>　　在對(duì)蒲桃的研究中，與生理特性、栽培技術(shù)、引種情況、物種比較等方面相關(guān)的比較多，雖然已有文獻(xiàn)報(bào)道了蒲桃屬植物中總黃

19、酮的提取工藝研究，但其中以蒲桃葉居多，具體到蒲桃莖提取工藝優(yōu)化研究仍是甚少。張亮亮[18]等人研究確定了海南蒲桃葉中黃酮的最佳提取條件為：乙醇體積分?jǐn)?shù)70%，料液比1:20，提取溫度80℃，提取時(shí)間3h。由此可將其結(jié)果作為參考，對(duì)蒲桃莖中總黃酮的提取條件進(jìn)行更進(jìn)一步的研究。蒲桃在我國(guó)資源量巨大，用途眾多，是值得大力開發(fā)的植物資源，且中草藥的具體化學(xué)成分提取、研究與應(yīng)用日益受到重視，國(guó)內(nèi)外開發(fā)中草藥植物的力度也在不斷加大。</p&g

20、t;<p>　　近年來，植物藥以其天然低毒、來源豐富的特點(diǎn)倍受青睞，而黃酮類化合物更是以其廣譜的生理、藥理作用引人矚目。因此，以黃酮類化合物為活性成分的植物藥的開發(fā)、研究和加工越發(fā)受到科學(xué)家們的重視。作為石岐涼茶的成分之一的蒲桃，目前仍非常少以藥物的身份出現(xiàn)在市面上，由此可見，隨著該相關(guān)技術(shù)的日趨成熟，蒲桃中的黃酮類化合物的開發(fā)利用更具有廣闊的前景。</p><p>　　綜上所述，蒲桃在我國(guó)資源豐富

21、，藥用層面利用卻較少，本次實(shí)驗(yàn)研究可確定蒲桃莖中總黃酮的最佳提取條件，為科學(xué)研究蒲桃莖的藥理作用、研發(fā)蒲桃相關(guān)藥物新劑型、推廣蒲桃藥物的生產(chǎn)等提供可靠的數(shù)據(jù)。有效的提取方式是進(jìn)行其他深層研究的先決條件，本次研究有助于更進(jìn)一步對(duì)蒲桃各相關(guān)資源進(jìn)行開發(fā)利用。</p><p><b>　　2 儀器與材料</b></p><p>　　2.1 儀器

22、 </p><p><b>　　2.2 藥材與試劑</b></p><p><b>　　3 方法</b></p><p>　　3.1 蒲桃總黃酮含量測(cè)定方法</p><p>　　3.1.1 對(duì)照品溶液的的制備</p><p>　　取蘆丁對(duì)照品6mg

23、，精密稱定，置于20mL容量瓶，加70%乙醇溶液適量，振搖使其溶解，用70%乙醇溶液稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品儲(chǔ)備液Ⅰ，蘆丁濃度為0.3080mg/mL。同法配制對(duì)照品儲(chǔ)備液Ⅱ，蘆丁濃度為2.920mg/mL。</p><p>　　3.1.2 供試品溶液的制備</p><p>　　取蒲桃粉末(過三號(hào)篩)1.0g，精密稱定，加70%乙醇溶液70mL，加熱回流提取2h，提取液趁熱過濾，濾液蒸

24、干，殘?jiān)?0%乙醇溶液溶解，轉(zhuǎn)移至25mL量瓶中，加70%乙醇溶液稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。</p><p><b>　　3.2 方法學(xué)考察</b></p><p>　　3.2.1 線性關(guān)系考察</p><p>　　精密量取對(duì)照品儲(chǔ)備液I0.5、1.0、1.5、2.0和2.5mL，分別置于10mL容量瓶中，加入5%亞硝酸鈉溶液0.5m

25、L，6min后，加入10%硝酸鋁0.5mL，6min后，再加入4%氫氧化鈉5mL，加入70%乙醇溶液定容至刻度，搖勻，放置15min，作為對(duì)照品系列溶液，以不含蘆丁的空白溶液為參比，于510nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以對(duì)照品濃度(X)為橫坐標(biāo)，相應(yīng)對(duì)照品吸光度(Y)為縱坐標(biāo)，繪制濃度-吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線。</p><p>　　3.2.2 精密度試驗(yàn)</p><p>　　取蒲桃粉末(過三號(hào)篩)1.0

26、g，精密稱定，按“3.1.2”項(xiàng)下方法，制備供試品溶液，精密量取供試品溶液2mL，按“3.2.1”項(xiàng)下方法操作，測(cè)定其吸光度，重復(fù)6次，分別測(cè)定其吸光度，計(jì)算吸光度的RSD。</p><p>　　3.2.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)</p><p>　　取蒲桃粉末(過三號(hào)篩)1.0g，精密稱定，按“3.1.2”項(xiàng)下方法，制備供試品溶液，精密量取供試品溶液2mL，按“3.2.1”項(xiàng)下方法操作，分別在0、0

27、.5、1.0、1.5、2.0和2.5h時(shí)，測(cè)定其吸光度，計(jì)算吸光度的RSD。</p><p>　　3.2.4 重復(fù)性試驗(yàn)</p><p>　　取蒲桃粉末(過三號(hào)篩)1.0g，精密稱定，按“3.1.2”項(xiàng)下方法，制備供試品溶液6份，分別精密量取供試品溶液2mL，按“3.2.1”項(xiàng)下方法操作，測(cè)定其吸光度，計(jì)算總黃酮含量的平均值和RSD。</p><p>　　3.2.5

28、 加樣回收率試驗(yàn)</p><p>　　取已知含量的供試品粉末(總黃酮的含量為5.888mg/g)9份，每份約0.5g，精密稱定，分別加入對(duì)照品儲(chǔ)備液Ⅱ0.5、1.0和1.5mL，按“3.1.2”項(xiàng)下方法操作，制備供試品溶液，每個(gè)濃度3份，分別精密量取供試品溶液2mL，按“3.2.1”項(xiàng)下方法操作，測(cè)定其吸光度，計(jì)算總黃酮的平均回收率和RSD。</p><p>　　3.2.6 樣品含量測(cè)定&

29、lt;/p><p>　　取3個(gè)不同批次，每批次三份的蒲桃粉末（過三號(hào)篩）共9份，每份1.0g，精密稱定，按“3.1.2”項(xiàng)下方法操作，制備供試品溶液，分別精密量取供試品溶液2mL，按“3.2.1”項(xiàng)下方法操作，測(cè)定其吸光度值，計(jì)算每批次蒲桃中總黃酮的含量及其RSD。</p><p>　　3.3 單因素考察方法</p><p>　　3.3.1 乙醇濃度對(duì)提取的影響<

30、/p><p>　　取蒲桃粉末(過三號(hào)篩)1.0g，精確稱定，共5份，分別加入50%、60%、70%、80%和90%乙醇溶液，按“3.1.2”項(xiàng)下方法，制備供試品溶液，分別精密量取供試品溶液2mL，按“3.2.1”項(xiàng)下方法操作，測(cè)定其吸光度，計(jì)算總黃酮的含量，繪制相關(guān)折線圖。</p><p>　　3.3.2 提取時(shí)間對(duì)提取的影響</p><p>　　取蒲桃粉末(過三號(hào)篩)

31、1.0g，精確稱定，共5份，分別加入70%乙醇溶液50mL，加熱回流提取時(shí)間分別為1.0、1.5、2.0、2.5和3.0h，其余操作按“3.1.2”項(xiàng)下方法，制備供試品溶液，分別精密量取供試品溶液2mL，按“3.2.1”項(xiàng)下方法操作，測(cè)定其吸光度，計(jì)算總黃酮的含量，繪制相關(guān)折線圖。</p><p>　　3.3.3 料液比對(duì)提取的影響</p><p>　　取蒲桃粉末(過三號(hào)篩)1.0g，精確

32、稱定，共5份，分別加入70%乙醇溶液50mL、60mL、70mL、80mL和90mL，其余操作按“3.1.2”項(xiàng)下方法，制備供試品溶液，分別精密量取供試品溶液2mL，按“3.2.1”項(xiàng)下方法操作，測(cè)定其吸光度，計(jì)算總黃酮的含量，繪制相關(guān)折線圖。</p><p>　　3.3.4 提取溫度對(duì)提取的影響</p><p>　　取蒲桃粉末(過三號(hào)篩)1.0g，精確稱定，共5份，按“3.1.2”項(xiàng)下方

33、法操作，提取溫度分別設(shè)在60℃、70℃、80℃和90℃，制備供試品溶液，分別精密量取供試品溶液2mL，按“3.2.1”項(xiàng)下方法操作，測(cè)定其吸光度，計(jì)算總黃酮的含量，繪制相關(guān)折線圖。</p><p>　　3.4 蒲桃中總黃酮提取的正交試驗(yàn)</p><p>　　根據(jù)蒲桃總黃酮的性質(zhì)，考察了乙醇濃度、提取時(shí)間、料液比、提取溫度4個(gè)因素，并結(jié)合以上單因素試驗(yàn)結(jié)果，設(shè)置4因素3水平正交試驗(yàn)見表1，根

34、據(jù)因素水平表，以蒲桃總黃酮含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，按L9(34)正交表進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。正交試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理采用正交試驗(yàn)直觀分析法，統(tǒng)計(jì)不同水平下提取出蒲桃中總黃酮含量的平均含量，以極差R進(jìn)行分析。</p><p>　　表1 正交優(yōu)選因素水平</p><p><b>　　4 結(jié)果</b></p><p>　　4.1 方法學(xué)考察結(jié)果</p><p

35、>　　4.1.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立</p><p>　　對(duì)照品溶液于510nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度結(jié)果見表2，以對(duì)照品濃度(X)為橫</p><p>　　坐標(biāo)，相應(yīng)對(duì)照品吸光度值(Y)為縱坐標(biāo)，繪制而成的標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為</p><p>　　Y=9.600×10-3X-1.030×10-2(r=0.9998)(r>0.9990)，見圖1

36、。結(jié)果表明，蘆丁在15.40～77.00μg/mL濃度范圍內(nèi)與吸光度呈良好線性關(guān)系。</p><p>　　表2 蒲桃總黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定結(jié)果</p><p>　　圖1 含量測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線</p><p>　　4.1.2 儀器精密度試驗(yàn)結(jié)果</p><p>　　試驗(yàn)結(jié)果見表3，吸光度的RSD為0.12%。結(jié)果表明，所使用儀器精密度良好。</p

37、><p>　　表3 儀器精密度試驗(yàn)結(jié)果（n=6）</p><p>　　4.1.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果</p><p>　　試驗(yàn)結(jié)果見表4，吸光度的RSD為0.48%。結(jié)果表明，此樣品于室溫條件下放置2.5h內(nèi)穩(wěn)定。</p><p>　　表4 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果（n=6）</p><p>　　4.1.4 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果</p&

38、gt;<p>　　試驗(yàn)結(jié)果見表5，吸光度的RSD為0.77%。結(jié)果表明，此方法重復(fù)性良好。</p><p>　　表5 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果（n=6）</p><p>　　4.1.5 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果</p><p>　　試驗(yàn)結(jié)果見表6，計(jì)算得出總黃酮的平均回收率為99.4%，RSD為1.4%。符合分析要求。</p><p>　　表6

39、 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果 (n=3)</p><p>　　4.1.6 樣品含量測(cè)定結(jié)果</p><p>　　試驗(yàn)結(jié)果見表7，3個(gè)不同批次的RSD分別為0.55%、0.49%、1.1%，符合分析要求。</p><p>　　表7 樣品含量測(cè)定結(jié)果 (n=3)</p><p>　　4.2 單因素考察結(jié)果</p><p>　　4.

40、2.1 乙醇濃度影響考察結(jié)果</p><p>　　考察結(jié)果見表8，圖2，蒲桃總黃酮提取含量隨溶劑濃度增加而變化，60%～70%乙醇溶液提取出的總黃酮含量最大。</p><p>　　表8 乙醇濃度的選擇</p><p>　　圖2 乙醇濃度對(duì)提取的影響</p><p>　　4.2.2 提取時(shí)間影響考察結(jié)果</p><p>

41、　　考察結(jié)果見表9，圖3，其他因素不變，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，蒲桃總黃酮的提取率逐漸增加，1.5h～2.5h為蒲桃總黃酮的最佳提取時(shí)間范圍。</p><p>　　表9 提取時(shí)間的選擇</p><p>　　圖3 提取時(shí)間對(duì)提取的影響</p><p>　　4.2.3 料液比影響考察結(jié)果</p><p>　　考察結(jié)果見表10，圖4，料液比對(duì)蒲桃總黃酮的提

42、取效率的影響隨著提取溶劑體積的變化而變化，1:60～1:80為蒲桃總黃酮最佳提取料液比范圍。</p><p>　　表10 料液比的選擇</p><p>　　圖4 料液比對(duì)提取的影響</p><p>　　4.2.4 提取溫度影響考察結(jié)果</p><p>　　考察結(jié)果見表11，圖5，隨著提取溫度的升高，蒲桃總黃酮的提取率逐漸增加，70℃～90℃為

43、蒲桃總黃酮的最佳提取溫度范圍。</p><p>　　表11 提取溫度的選擇</p><p>　　圖5 提取溫度對(duì)提取的影響</p><p>　　4.3 蒲桃總黃酮提取的正交試驗(yàn)優(yōu)選結(jié)果</p><p>　　根據(jù)蒲桃總黃酮的性質(zhì)，考察了乙醇濃度、提取時(shí)間、料液比、提取溫度4個(gè)因素，并結(jié)合以上單因素試驗(yàn)結(jié)果，設(shè)置4因素3水平正交試驗(yàn)見表1，根據(jù)因

44、素水平表，以蒲桃總黃酮含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，按L9(34)正交表進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。正交試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理采用正交試驗(yàn)直觀分析法，統(tǒng)計(jì)不同水平下提取出蒲桃總黃酮含量的平均含量，以極差R進(jìn)行分析，結(jié)果見表12。</p><p>　　表12 正交試驗(yàn)結(jié)果分析</p><p>　　極差R的結(jié)果表明，乙醇濃度、提取時(shí)間、料液比、提取溫度4因素對(duì)蒲桃總黃酮提取含量的影響的顯著性為：提取溫度＞乙醇濃度＞提取時(shí)間＞料液比。蒲

45、桃總黃酮加熱回流提取的最優(yōu)水平搭配為A1B2C2D2，即乙醇濃度為60%，提取時(shí)間為2h，料液比1:70，提取溫度80℃為蒲桃中總黃酮的最佳提取工藝。在此條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，重復(fù)試驗(yàn)值為6.499mg/g，RSD為0.35%，符合預(yù)測(cè)值，說明該方法優(yōu)選出來的工藝條件準(zhǔn)確可靠。</p><p><b>　　5 討論</b></p><p>　　5.1 最大吸收波長(zhǎng)的選擇

46、：</p><p>　　取對(duì)照品溶液經(jīng)顯色處理后，以不含蘆丁的空白溶液為參比，將待測(cè)液盛于比色皿中，置于比色池中，在200～600nm波長(zhǎng)段掃描測(cè)定最大吸收度，結(jié)果顯示，對(duì)照品及供試品均在510nm處有最大吸收，故選擇510nm為測(cè)定波長(zhǎng)。</p><p>　　5.2 提取條件影響程度分析</p><p>　　5.2.1 溶劑濃度的影響</p><

47、;p>　　提取黃酮類化合物的乙醇液濃度一般在60%～95%之間，60%左右濃度的乙醇溶液適合提取黃酮苷類，90%～95%的乙醇溶度適于提取游離黃酮。故本次實(shí)驗(yàn)中采取了50%、60%、70%、80%、90%五個(gè)梯度濃度，由實(shí)驗(yàn)中可看出隨著乙醇濃度的上升，提取出來的黃酮量先上升后下降。實(shí)驗(yàn)中所出現(xiàn)的乙醇液濃度增大導(dǎo)致黃酮提取量減小的現(xiàn)象，可能是因?yàn)榇嬖诓糠执既苄噪s質(zhì)有關(guān)。隨著乙醇液濃度增大，這部分雜質(zhì)溶出率也增大，與黃酮類化合物競(jìng)爭(zhēng)，

48、并且和乙醇-水分子進(jìn)行結(jié)合，使得黃酮類化合物溶出減少。</p><p>　　5.2.2 提取時(shí)間的影響</p><p>　　由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可看出，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，總黃酮的提取量呈現(xiàn)先陡然上升后平緩上升的趨勢(shì)，從2h后總黃酮的提取量增加量微乎其微，提取率趨于穩(wěn)定。綜合耗時(shí)長(zhǎng)短、經(jīng)濟(jì)利益、資源耗費(fèi)量等多方面因素，可確定1.5h～2.5h為理想的提取時(shí)間范圍。</p><p&

49、gt;　　5.2.3 料液比的影響</p><p>　　料液比，指固態(tài)的“料”的質(zhì)量與作為浸提液的“液”的體積的比。本次實(shí)驗(yàn)中料液比的單位為g/mL，蒲桃總黃酮的提取率隨著所用提取溶劑體積的增大先增大后減小，料液比太大時(shí)，可能由于乙醇濃度大而產(chǎn)生如“5.2.1”項(xiàng)中所述情況，導(dǎo)致黃酮溶出率減小。</p><p>　　5.2.4 提取溫度的影響</p><p>　　將

50、提取溫度的考察區(qū)間設(shè)置為60～90℃。單因素考察結(jié)果顯示，一定范圍內(nèi)提高溫度，可以促進(jìn)蒲桃中總黃酮溶出，在此區(qū)間內(nèi)，提取率與溫度成正比。</p><p>　　5.3 顯色反應(yīng)分析</p><p>　　本實(shí)驗(yàn)利用紫外分光光度法測(cè)定總黃酮過程中，采用比色法，以亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉為顯色劑，在提取液中加入亞硝酸鈉與硝酸鋁后,亞硝酸鈉起還原作用，被還原的黃酮類化合物再與鋁鹽生成絡(luò)和物,最后加

51、入氫氧化鈉溶液，生成2’-羥基查耳酮使提取液顯色,從而可在510nm波長(zhǎng)處出現(xiàn)吸收峰，進(jìn)行含量測(cè)定。這種顯色的化合物不穩(wěn)定,在實(shí)驗(yàn)操作中可以明顯感受到這個(gè)特性，因此，實(shí)際操作中，應(yīng)該安排好實(shí)驗(yàn)步驟與操作時(shí)間，盡量在相同實(shí)驗(yàn)條件、相同環(huán)境條件下，且在短時(shí)間內(nèi)快速測(cè)出吸光度,這樣才能保證結(jié)果的準(zhǔn)確度. </p><p><b>　　6 結(jié)論</b></p><p>　　本

52、實(shí)驗(yàn)采用乙醇液加熱回流提取方法對(duì)蒲桃中的總黃酮進(jìn)行提取，選用蘆丁作為對(duì)照品，以亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉為顯色劑，用紫外分光光度法在510nm處測(cè)定所提取的總黃酮的含量。</p><p>　　實(shí)驗(yàn)中采用L9(34)正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，以蒲桃中總黃酮含量為考察指標(biāo)，考察乙　　醇濃度、提取時(shí)間、料液比、提取溫度4個(gè)因素對(duì)提取的影響，結(jié)果可看出4個(gè)因素對(duì)蒲桃總黃酮提取含量的影響的顯著性為：提取溫度＞乙醇濃度＞提取時(shí)間＞料液比

53、。由正交設(shè)計(jì)法優(yōu)選出來的蒲桃總黃酮加熱回流提取最佳提取條件為：乙醇濃度為60%，提取時(shí)間為2h，料液比1:70，提取溫度80℃。該方法優(yōu)選出來的工藝簡(jiǎn)單易操作，穩(wěn)定性好，經(jīng)濟(jì)可行，便于推廣使用。在實(shí)際生產(chǎn)中，同時(shí)也要考慮溶劑消耗，濃縮回收溶劑的耗能等因素，根據(jù)實(shí)際情況適當(dāng)調(diào)整工藝。</p><p><b>　　參考文獻(xiàn)</b></p><p>　　[1] 中國(guó)科學(xué)院《

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63、屬桃金娘科蒲桃屬，為常綠喬木或小喬木。別名有水蒲桃、香果、響鼓、風(fēng)鼓和鈴鐺果。蒲桃原產(chǎn)于印度、馬來群島和菲律賓等地，在我國(guó)的栽種歷史頗為悠久。蒲桃集中分布在亞洲亞熱帶，我國(guó)境內(nèi)主要包括海南、廣東、廣西、福建、云南等地。蒲桃喜溫暖多濕的氣候，喜光耐陰；喜濕潤(rùn)，常生長(zhǎng)在溪邊或溝谷低濕的地方，耐陰濕耐澇，不耐干旱，比較適宜生長(zhǎng)在肥沃濕潤(rùn)的酸性土壤或沖積土上[1-3]。蒲桃具有多領(lǐng)域作用——可制成果膏、果餞；可研制成為花茶；其果實(shí)、種子、莖葉均

64、可入藥，是沙溪涼茶的主要成分之一，有抗菌[4，5]、抗炎[6]、降血糖[7]和抗氧化[8]等作用；其次還可用于園林綠化或作為觀賞植物[2]。</p><p><b>　　2蒲桃的化學(xué)成分</b></p><p><b>　　2.1揮發(fā)油類</b></p><p>　　蒲桃揮發(fā)油的化學(xué)成分在不同部位中存在差異，蒲桃莖中主要為

65、酸類化合物，而花葉中為單萜、倍半萜、及其二者的氧化物。其中蒲桃葉中含量最高的成分為丁香烯-5-醇，而花莖中的揮發(fā)油主成分均為十六酸[9]。</p><p><b>　　2.2黃酮類</b></p><p>　　羅濟(jì)文[10]使用破碳電極，pH值為4.0的磷酸鹽緩沖溶液，差分脈沖法對(duì)蒲桃葉中的蘆丁含量進(jìn)行測(cè)定，測(cè)得蘆丁質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15.7mg/g，另外采用分光光度法測(cè)得的

66、黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)為24.5mg/g。</p><p><b>　　2.3三萜類化合物</b></p><p>　　林大都[11]在蒲桃莖化學(xué)成分研究中，分離得到6個(gè)三萜酸類化合物，對(duì)其進(jìn)行薄層鑒別分析后，結(jié)果找到5個(gè)對(duì)應(yīng)斑點(diǎn)（除了麥珠子酸），并且結(jié)果表明蒲桃莖乙酸乙酯提取物的主成分之一是三萜酸類化合物。</p><p>　　此外，蒲桃中還有其他化學(xué)

67、成分，如鞣酸類，以及其他含量較少的成分。</p><p><b>　　3蒲桃的藥理作用</b></p><p><b>　　3.1抗氧化</b></p><p>　　張鏡、刁樹平[12]對(duì)海南蒲桃果實(shí)中的原花青素進(jìn)行體外抗氧化活性的相關(guān)藥理研究，通過分析研究海南蒲桃原花青素分別對(duì)DPPH自由基、超氧陰離子自由基、羥自由基和

68、亞油酸脂質(zhì)過氧化半抑制劑量，得出海南蒲桃原花青素總抗氧化、還原力明顯高于VC、金屬離子螯合力高于EDTA的結(jié)論。由此表明海南蒲桃原花青素具有較強(qiáng)的清除自由基與抗氧化活性等體外生物活性。</p><p><b>　　3.2降血糖</b></p><p>　　邱雪蓮[7]等人用海南蒲桃籽提取物以不同劑量連續(xù)15d對(duì)自發(fā)性2型糖尿病KK/4pj-Ay/J小鼠灌胃給藥，結(jié)果試

69、驗(yàn)組小鼠的空腹血糖和糖耐量得到顯著改善，而對(duì)小鼠體重影響不大。</p><p>　　3.3抗菌、抗炎、鎮(zhèn)痛</p><p>　　Djipa CD[4]等人采用瓊脂稀釋法對(duì)蒲桃樹皮提取物的抗菌活性進(jìn)行體外測(cè)試，他們研究發(fā)現(xiàn)蒲桃樹皮提取物對(duì)于抑制金黃色葡萄球菌尤其有效，對(duì)凝固酶陰性葡萄球菌也有一定作用，由此證明了蒲桃樹皮提取物具有抗菌活性。</p><p>　　D. &

70、#193;vila-Peña, N. Peña[6]等人對(duì)實(shí)驗(yàn)小鼠進(jìn)行皮下注射，通過熱板試驗(yàn)、福爾馬林試驗(yàn)和握力試驗(yàn)，分別評(píng)估蒲桃提取物對(duì)熱刺激性皮膚疼痛、炎癥性皮膚疼痛和肌肉疼痛的鎮(zhèn)痛效果，研究證明蒲桃提取物能對(duì)皮膚疼痛產(chǎn)生一個(gè)持久的鎮(zhèn)痛效果，可媲美于嗎啡。對(duì)炎癥性皮膚疼痛，其療效高于抗炎藥雙氯芬酸。在對(duì)抗肌肉疼痛方面，正常情況下并沒有明顯改變，但對(duì)于炎癥引起的肌肉疼痛，蒲桃提取物可顯著降低肌肉痛覺敏感度。由此表明

71、了蒲桃提取物具有抗炎鎮(zhèn)痛的藥理作用。</p><p><b>　　4蒲桃的用途</b></p><p><b>　　4.1食用</b></p><p>　　蒲桃果實(shí)為核果狀漿果。果肉呈白色，味酸甜，水分較少，可供鮮食、制果膏果醬、制蜜餞等，果汁經(jīng)發(fā)酵后還可制成飲料。此外，蒲桃始花期為2月，盛花期5月份，6月底為末期，但7月

72、到12月仍保持開放少量花?？梢娖烟一ㄆ陂L(zhǎng)且花量大，因此市場(chǎng)上又用蒲桃花窨制低檔烏龍茶，制成花茶；且蒲桃花花粉花蜜均較多，香氣濃，又可成為良好的蜜源[1,2,13]。</p><p><b>　　4.2藥用</b></p><p>　　蒲桃與崗梅、鐵包金等共同組成石岐外感涼茶，具有疏風(fēng)清熱、解暑消食、鎮(zhèn)咳等功效，臨床用于治療外感發(fā)熱、頭痛、咳嗽等癥狀和預(yù)防流行性感冒[1

73、4]。蒲桃具有抗炎抗菌等功效，可用于治療痘瘡、腸炎、痢疾。蒲桃種子提取物具有降低血糖之功效，可用于治療糖尿病。蒲桃果肉可治呃逆不止，肺胃虛寒所致咳嗽。海南蒲提取物對(duì)L6細(xì)胞砷中毒有緩解作用，可考慮將其應(yīng)用到砷中毒的治療當(dāng)中[15]。</p><p><b>　　4.3園林應(yīng)用</b></p><p>　　蒲桃屬植物，桃金娘科，常綠喬木或灌木，樹形優(yōu)美，樹冠茂密，生長(zhǎng)快

74、速，根系發(fā)達(dá)，具有強(qiáng)抗二氧化硫能力，可抗污染、防風(fēng)，是良好的園林綠化樹種，且其枝繁葉茂，花香淡雅，亦可作為園景觀賞植物[3]。</p><p><b>　　5黃酮的藥理作用</b></p><p>　　據(jù)各種文獻(xiàn)及相關(guān)資糧記載，黃酮作為一類低分子的天然活性物質(zhì)，具有對(duì)人體意義重大的多種生理活性。</p><p>　　張永忠[16]等人使用四種不

75、同濃度的異黃酮溶液進(jìn)行對(duì)豬油的抗氧化實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)表明，異黃酮具有清除羥自由基、超氧陰離子自由基等作用，并且異黃酮中所含羥基個(gè)數(shù)及羥基位置的差異可能會(huì)影響其抗氧化能力。</p><p>　　黃酮具有抗腫瘤功效，可通過從多方面作用于腫瘤細(xì)胞而起到抑制腫瘤發(fā)生、增殖、遷移、侵襲等效果，包括抑制細(xì)胞周期、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和影響細(xì)胞的信號(hào)傳導(dǎo)等[17]。</p><p>　　黃酮類物質(zhì)對(duì)心血管系統(tǒng)也有明顯

76、的作用，其藥理作用主要有抑制血小板功能以減少血小板聚集，降低甘油三酯、低密度脂蛋白等以調(diào)節(jié)血脂水平，防止過氧化的低密度脂蛋白損傷血管細(xì)胞，和預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化等方面[18]。</p><p>　　此外，黃酮類化合物的共同藥理作用還有抗炎、抗病毒、抗骨質(zhì)疏松等[19,20]。</p><p><b>　　6黃酮的提取方法</b></p><p>　

77、　黃酮類化合物存在植物體內(nèi)種類繁多，狀態(tài)不一，其對(duì)應(yīng)的提取方法也各式各樣，有溶劑提取法、超聲提取法、超濾法、超臨界流體萃取法、酶解法、微波提取法、大孔樹脂吸附法等[21-23]。</p><p><b>　　6.1溶劑提取法</b></p><p>　　水提法由于提取效率差，雜質(zhì)多，后處理繁雜，故不常用。常用的提取溶劑為甲醇和乙醇，而由于乙醇無毒安全性高，實(shí)際生產(chǎn)和研

78、究中往往更傾向于乙醇。極性小的溶劑，如氯仿、乙醚等和高濃度的醇（90%～95%）更適于提取苷元；苷類宜用極性較大的溶劑提取，如甲醇、乙醇、丙酮等，醇濃度為60%左右為宜。</p><p><b>　　6.2超聲提取法</b></p><p>　　超聲波提取原理是利用超聲波在液體中產(chǎn)生“空穴作用”，破壞植物細(xì)胞和細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，從而增加細(xì)胞內(nèi)容物通過細(xì)胞膜的穿透能力，有助于

79、黃酮類化合物的釋放與溶出。超聲波提取操作極其簡(jiǎn)便，設(shè)備裝置簡(jiǎn)單，無需另置加熱，提取效率高，可以避免高溫對(duì)提取成分的破壞。</p><p><b>　　6.3微波提取法</b></p><p>　　微波提取法是利用微波（頻率在300～300,000MHz之間的電磁波）的高頻電磁波穿透提取介質(zhì)，加速被提取成分向提取溶劑界面的擴(kuò)散速率，縮短提取組分分子的擴(kuò)散時(shí)間，提高提取速

80、率。微波提取法環(huán)保、提取率高、速度快、節(jié)省溶劑、副產(chǎn)物少，可對(duì)其進(jìn)行進(jìn)一步的研究，擴(kuò)大其在實(shí)際生產(chǎn)中的應(yīng)用。</p><p>　　6.4超臨界流體萃取法</p><p>　　超臨界流體萃取法常使用CO2作為溶劑，其原理是利用超臨界流體的溶解能力與其密度的關(guān)系，即利用壓力和溫度對(duì)超臨界流體溶解能力的影響而進(jìn)行的。在超臨界狀態(tài)下，將超臨界流體與待分離的物質(zhì)接觸，使其有選擇性地把極性大小、沸點(diǎn)高

81、低和分子量大小的成分依次萃取出來。CO2穩(wěn)定、安全性高、無毒、來源廣，該提取方法萃取速度快、效率高、且沒有溶劑殘留的問題存在，屬于先進(jìn)高效的新生技術(shù)，但是技術(shù)要求高、價(jià)格昂貴，目前還難以投入到實(shí)際大規(guī)模生產(chǎn)中。</p><p>　　7蒲桃中總黃酮的研究展望</p><p>　　蒲桃雖在傳統(tǒng)使用中歷史悠久，其在食用及園林綠化應(yīng)用中較為常見，在民間使用頻率也不低，但其并未編入中華人民共和國(guó)藥典

82、當(dāng)中，在臨床藥物應(yīng)用中頻率低、范圍窄，沒有得到很好的推廣使用。一直以來對(duì)蒲桃的研究處于不溫不火的層面，至今還沒有形成一個(gè)全面系統(tǒng)的研究成果。但我們也可以看到，近幾年國(guó)內(nèi)外對(duì)蒲桃的藥理作用、化學(xué)成分鑒定、提取方法等方面的研究也在不斷深入。隨著化學(xué)用藥副作用多、開發(fā)周期長(zhǎng)、用藥相對(duì)昂貴等缺點(diǎn)的日益顯現(xiàn)，經(jīng)濟(jì)、來源廣、純天然的中藥藥物日益受到青睞。蒲桃在我國(guó)資源豐富，價(jià)廉易得，且安全性高，而黃酮類化合物具有多種對(duì)人體有利的生理活性，提取較易，

83、且研究程度較高，因此，對(duì)蒲桃中的總黃酮進(jìn)行研究開發(fā)利用具備一定的可行性和經(jīng)濟(jì)效益。目前所做的針對(duì)蒲桃藥理的研究，多停留在蒲桃種子和蒲桃葉，對(duì)蒲桃莖的研究非常少，本次研究?jī)?yōu)化蒲桃莖中總黃酮的提取工藝，可以為蒲桃的藥理研究、化學(xué)成分等提供可靠數(shù)據(jù)，使蒲桃得到更充分的開發(fā)利用。</p><p><b>　　參考文獻(xiàn)</b></p><p>　　[1] 杜華波.熱帶亞熱帶果樹

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