玉米種子活力的生理學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)研究.pdf

1、以玉米雜交種鄭單958種子為實(shí)驗(yàn)材料,利用人工加速老化處理、TTC染色法和種子萌發(fā)實(shí)驗(yàn),對(duì)種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)及多項(xiàng)生理指標(biāo),尤其是種子蛋白質(zhì)組的變化進(jìn)行了比較研究,以鑒定鄭單958種子活力的標(biāo)記蛋白質(zhì)分子。主要研究結(jié)果如下:
　　 1、老化處理后,種子多項(xiàng)生理指標(biāo)發(fā)生了明顯變化
　　 種子活力隨著老化處理進(jìn)程而降低。和對(duì)照相比,老化1天的種子發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽率分別降低了7％和3％；老化2天和3天的發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽率急劇降低,到

2、老化第三天,發(fā)芽勢(shì)降低了74％,發(fā)芽率降低了64％；老化6天的發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽率全部為O。說明種子發(fā)芽勢(shì)對(duì)老化處理的敏感性要高于發(fā)芽率。TTC染色結(jié)果顯示,種子活力隨著老化程度的加劇而降低,自然老化和人工老化的種子均可分為染色深、淺和不染色的三類,但TTC法測(cè)定的種子活力要高于發(fā)芽實(shí)驗(yàn)的測(cè)定結(jié)果。
　　 在人工加速老化過程中,隨著種子劣變加劇,種子內(nèi)MDA和可溶性糖含量增加。MDA含量隨老化時(shí)間逐漸升高,可溶性糖含量在老化第2天最高

3、:抗氧化系統(tǒng)的SOD、CAT和POD三種酶活性均隨著老化天數(shù)的增加而降低。而POD酶活性在老化2天后變化不明顯；可溶性蛋白質(zhì)含量也因老化處理而緩慢下降。
　　 2、老化處理后,種子蛋白質(zhì)組發(fā)生了明顯變化,尤其是種胚的蛋白質(zhì)組
　　 SDS—PAGE分析表明,老化過程在促進(jìn)玉米種子蛋白質(zhì)降解的同時(shí),也誘導(dǎo)一些蛋白質(zhì)的豐度上調(diào)和新蛋白質(zhì)的合成；胚乳與種胚蛋白質(zhì)均出現(xiàn)了差異,尤其是在種胚中。對(duì)不同活力種胚的蛋白質(zhì)電泳分析發(fā)現(xiàn),

4、一種14 kDa蛋白質(zhì)豐度的變化最大:在低活力種子中的含量明顯減少。
　　 鑒于老化6天與0天(對(duì)照)的種胚蛋白質(zhì)差異顯著,取對(duì)照和老化6天的種胚蛋白質(zhì)進(jìn)行了2-D電泳分析。雙向電泳凝膠上可分辨出約750個(gè)考染的蛋白質(zhì)點(diǎn),選取豐度變化在3倍以上的4個(gè)點(diǎn)(包括上述14 kDa蛋白質(zhì))進(jìn)行質(zhì)譜鑒定。同源性序列比對(duì)表明,這四種蛋白質(zhì)分別是胚胎晚期豐富蛋白質(zhì)(LEA)EMB564(Swissprot登錄號(hào)P46517)、表達(dá)蛋白(NCB

5、I登錄號(hào)NP_001142211)、脂蛋白(Swissprot登錄號(hào)ACG48482)和葡糖/果糖脫氫酶(NCBI登錄號(hào)NP_001140439)。上述14kDa的蛋白質(zhì)為EMB564。
　　 3、盾片中的EMB564可作為鄭單958種子活力的標(biāo)記分子
　　 為進(jìn)一步確定EMB564在種胚中的組織定位,分別從未萌發(fā)的老化/對(duì)照種子的胚芽、胚根和盾片中提取蛋白質(zhì)進(jìn)行電泳分析。在未萌發(fā)的種子中,EMB564在胚芽、胚根和盾片

6、中均存在,其含量在老化、正常盾片中差異最明顯。在種子萌發(fā)過程中,盾片中EMB564含量隨著種子發(fā)育進(jìn)程而減少,可能是由于種子萌發(fā)過程中被重新利用。另外,發(fā)芽勢(shì)低的種子盾片中EMB564的豐度高于發(fā)芽高的,在活力較弱的種子盾片中幾乎不可見。2-D電泳分析和MALDI-TOF質(zhì)譜分析,進(jìn)一步證實(shí)了上述結(jié)果。
　　 通過信息生物學(xué)軟件分析了EMB564的親/疏水性以及二級(jí)、三級(jí)結(jié)構(gòu)。通過與已知的LEA蛋白質(zhì)序列同源性比對(duì)表明,EMB5

7、64是LEA第1家族中的成員。其二級(jí)結(jié)構(gòu)比較簡(jiǎn)單,包含了7個(gè)片段的不規(guī)則彎曲,占整個(gè)氨基酸序列的61.5％,3個(gè)片段屬于α-螺旋結(jié)構(gòu),占26％,無β-折疊結(jié)構(gòu)。EMB564的三級(jí)結(jié)構(gòu)與DNA結(jié)合蛋白相似,帶有兩個(gè)空間成垂直排列的α-螺旋,其余為無規(guī)則卷曲。目前關(guān)于LEA蛋白的功能還不清楚。EMB564的空間結(jié)構(gòu)暗示,它可能有結(jié)合DNA、在脫水干燥脅迫下起保護(hù)DNA的作用。
　　 本論文應(yīng)用生理學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)合的方法,發(fā)現(xiàn)EMB