利用rDNA序列對(duì)刺激隱核蟲、多子小瓜蟲相關(guān)生物學(xué)特性研究.pdf

1、多子小瓜蟲(Ichthyophthiorus multifiliis)和刺激隱核蟲(Cryptocaryon irritans)是目前經(jīng)濟(jì)魚類養(yǎng)殖業(yè)最為普遍和危害性最大的兩種寄生性纖毛蟲。近年來，這兩種纖毛蟲給淡水和海水養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。這兩種寄生蟲主要感染魚皮膚和鰓，分別引起淡水和海水魚類的“白點(diǎn)病”。本論文將從分子生物學(xué)角度，利用核糖體DNA(rDNA)基因序列對(duì)這兩種寄生蟲相關(guān)生物學(xué)特性進(jìn)行分析，同時(shí)利用其種間的遺傳差異

2、性，對(duì)蟲體及其內(nèi)共生體進(jìn)行鑒定，這將對(duì)這類纖毛蟲的系統(tǒng)發(fā)育、診斷和基礎(chǔ)生物學(xué)研究具有重要意義。 本論文分為四個(gè)部分： 1.刺激隱核蟲rDNA ITS遺傳標(biāo)記的研究 2.利用rDNA ITS序列建立特異PCR檢測(cè)方法 3.利用16S rDNA基因序列分析纖毛蟲的內(nèi)共生體 4.內(nèi)共生體的定位及功能研究 本研究從分子遺傳學(xué)角度出發(fā)，通過對(duì)不同地區(qū)多子小瓜蟲(Ichthyophthirius mu

3、ltifiliis，Ich)和刺激隱核蟲(Cryptocaryon irritans)的ITS-1及ITS—2進(jìn)行PCR擴(kuò)增和序列分析，確定其種間和種內(nèi)差異性，以明確ITS-1及ITS—2是否可作為小瓜蟲分子生物學(xué)分類的遺傳標(biāo)記。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：來自不同地區(qū)的C.irritans的ITS-1和ITS—2序列差異性分別為0～1.6％和0～2.1％，而C.irritans與I.multifiliis之間的ITS-1和ITS—2之間的差異性分別為5

4、0.1～51.3％和52.6～53.3％，各地理株C.irritans和I.multifiliis的5.8S均不存在序列差異性，由此，我們成功的確立了ITS作為魚類小瓜蟲遺傳標(biāo)記的地位，并且ITS—2相對(duì)于ITS-1更為敏感，為C.irritans的分子生物學(xué)的進(jìn)一步研究奠定了基礎(chǔ)。 根據(jù)已經(jīng)測(cè)得的C.irritans和I.multifiliis核糖體序列，通過網(wǎng)上Blast比對(duì)分析，設(shè)計(jì)、合成了針對(duì)C.irritans和I.m

5、ultifiliis的特異性引物P1-S15和S01-S02，通過PCR條件優(yōu)化和擴(kuò)增后，他們均能特異的擴(kuò)增出目的DNA片段，分別是540bp和280bp，其他對(duì)照樣品均未見擴(kuò)增出特異片段。敏感性試驗(yàn)可以檢測(cè)到最低濃度為45pg/ul。通過凍融方法和巢式PCR敏感性可以檢測(cè)到單個(gè)的幼蟲，該方法特異性強(qiáng)、敏感性較高、重復(fù)性好，不僅可用于C.irritans和I.multifiliis的分類鑒定，也可用于它們所導(dǎo)致的寄生蟲病的診斷和流行病學(xué)

6、調(diào)查。 在同一物種中，核糖體16S相對(duì)保守，可以作為種間鑒定的標(biāo)記序列。本研究通過16S rDNA序列的擴(kuò)增、克隆、分析首次獲得了多子小瓜蟲I.multifiliis的內(nèi)共生體序列。通過生物學(xué)軟件應(yīng)用分析獲得的16S序列，成功的發(fā)現(xiàn)這些序列與I.multifiliis的18S序列截然不同，而與Flavobacterium家族，Ricketsiales家族和Bacteroidetes家族這三個(gè)細(xì)菌的基因家族存在著非常高的相似性。由

7、此，我們成功的通過16S rDNA基因序列首次獲得了I.multifiliis的三種內(nèi)共生體。 在上面研究的基礎(chǔ)上，根據(jù)已經(jīng)獲得的內(nèi)共生體16S rDNA序列，通過網(wǎng)上比對(duì)，尋找其特異的基因區(qū)間，設(shè)計(jì)特異的DNA探針，通過熒光原位雜交技術(shù)(FISH)成功地確定其在I.multifiliis體內(nèi)的位置，與大多數(shù)的纖毛共生體相似，位于I.multifiliis的胞質(zhì)中，電鏡觀察結(jié)果同樣證實(shí)內(nèi)共生體分布在I.multifiliis報(bào)紙