河南地區(qū)人源隱孢子蟲生物學(xué)特性的實驗研究.pdf

1、背景和目的隱孢子蟲病(Cryptosporidiosis)是一種全球性的人獸共患寄生蟲病，有著重要公共衛(wèi)生意義。隱孢子蟲可寄生于禽類、哺乳類、爬行類和兩棲類等170種以上的人和動物。在人類患者主要引起腹瀉和呼吸道癥狀，艾滋病病人和兒童中的感染率分別高達48％和17.5％，可導(dǎo)致嚴重的水樣腹瀉甚至危及生命，免疫功能正常者也能感染出現(xiàn)急性自限性腹瀉。該病已被列為引起人類最常見的6種腹瀉疾病之一。 本文對河南地區(qū)3株人源隱孢子蟲分離株

2、進行了形態(tài)學(xué)測定、動物交叉感染試驗、致病性和組織病理研究，并進行了PCR和基因進化樹的構(gòu)建，來確定3個隱孢子蟲分離株的生物學(xué)特性。 對于隱孢子蟲病的深入研究，有賴于其動物模型的建立。3個隱孢子蟲分離株均能成功感染免疫力低下及免疫力正常的小白鼠。在3個分離株中，1號和2號分離株感染小白鼠后出現(xiàn)的臨床癥狀和病理變化基本一致，且明顯嚴重于3號分離株對小鼠的感染。此外1號和2號分離株感染小白鼠后的排隱孢子蟲卵囊規(guī)律幾乎一致，但二者與3號

3、分離株感染小白鼠后的排隱孢子蟲卵囊規(guī)律差別較大。在寄生部位上3者也有明顯的區(qū)別，1號、2號分離株主要寄生于小白鼠的回腸，3號分離株主要寄生于小白鼠的十二指腸。只有3號分離株能夠成功感染雛雞，并且3號分離株能夠使試驗雛雞出現(xiàn)嚴重的臨床癥狀和病理變化。在寄生部位上，3號分離株主要寄生于雛雞的回腸，這明顯區(qū)別于感染小白鼠時的十二指腸。結(jié)果表明1、2號分離株為同一個種屬，3號分離株為一個種屬。 參考Xiao等的資料合成引物，建立PCR擴

4、增18sDNA基因全序列，并對PCR擴增片段進行測序，利用Clustalx1.8、Paup4.0、Phylip3.6軟件進行序列分析比較、構(gòu)建分子進化樹，分析3個分離株的種類以及和其它蟲株之間的親緣進化關(guān)系。 利用4個不同的方法建樹基本沒有區(qū)別。PAUP4.0、Phylip3.6的NJ和MP法分析的結(jié)果基本完全一致，所比較的15個分離株較為一致的分別處于3個不同的進化枝上。各種分析方法均顯示1號、2號分離株與AF108864C.

5、parvumcattle構(gòu)成第一枝。3號分離株與AF112574(C.meleagridis/turkey/CMEL)陶成第一枝。說明3個人源隱孢子蟲分離株分別為：1號、2號分離株應(yīng)為小球隱孢子蟲(C.parvum)?；蛐停?號分離株應(yīng)為火雞隱孢子蟲(C.meleagridis)。 方法1.用飽和糖溶液漂浮法和齊——尼氏改良抗酸染色法檢查3個隱孢子蟲分離株，分別標注為1號、2號和3號，詳細觀察測量了3種卵囊形態(tài)。 2.

6、進行動物交叉感染試驗，并且觀察研究了各自的排卵囊規(guī)律、寄生部位、臨床癥狀、病理組織變化等。 3.根據(jù)發(fā)表的隱孢子蟲18sDNA基因序列，建立PCR方法，分別擴增出3個分離株約1700bp的片段，并對3個分離株的18sDNA基因進行測序，對測定序列用Clustalx1.8.1進行比對，之后用PAUP4.0、Phylip3.6等生物學(xué)軟件進行分子種系發(fā)育關(guān)系分析，構(gòu)建了基因進化樹，進而分析河南地區(qū)人源隱孢子蟲的種屬。 結(jié)果1

7、.對3株隱孢子蟲分離株進行形態(tài)學(xué)觀察，1號和2號分離株為同一個種類，3號分離株為另外一個種類。 2.詳細研究了3個隱孢子蟲分離株的生物學(xué)特性，發(fā)現(xiàn)1號、2號和3號分離株均能夠感染免疫力低下和免疫力正常的14日齡昆明系小白鼠，而只有3號分離株能夠感染試驗雛雞。1號、2號和3號分離株均能夠引起免疫抑制小白鼠的腹瀉，1號、2號分離株所引起的臨床癥狀幾乎一致，且明顯嚴重于3號分離株感染小白鼠的癥狀；3號分離株能夠引起免疫力低下及免疫力正

8、常的雛雞腹瀉癥狀，只是免疫抑制組雛雞的臨床癥狀更嚴重。3個分離株引起非免疫抑制組的小白鼠排隱孢子蟲卵囊規(guī)律均是一過性，未見明顯的臨床癥狀。 3.根據(jù)病理組織學(xué)研究，確定1號和2號分離株主要寄生于小白鼠的回腸、空腸，3號分離株寄生于小白鼠的十二指腸。但是，3號分離株主要寄生于雛雞的回腸部位，這與在小白鼠體內(nèi)的寄生部位有較大差別。 4.根據(jù)發(fā)表的隱孢子蟲18SrRNA基因序列，建立PCR方法，成功擴增出人源隱孢子蟲分離株約1

9、700bp的片段，并對其基因進行測序。對測定序列用Clustal1.8.1進行對比，之后用PAUP4.0、Phylipv3.6等生物學(xué)軟件進行分子種系發(fā)育關(guān)系分析，構(gòu)建了基因進化樹，確定了河南人源隱孢子蟲1號和2號分離株為小球隱孢子蟲(C.parvum)、而3號分離株為火雞隱孢子蟲(C.meleagridis)。 結(jié)論1.本研究在國內(nèi)首次根據(jù)蟲株的動物交叉感染試驗、病理組織學(xué)觀察以及分子生物學(xué)的方法，系統(tǒng)研究了人源隱孢子蟲的生物