FMDV受體豬源整聯(lián)蛋白αvβ6單克隆抗體制備及分布的研究.pdf

1、口蹄疫（food-and-mouth disease，F(xiàn)MD）是一種由口蹄疫病毒（foot-and-mouth disease virus，F(xiàn)MDV）引起的偶蹄動物急性高度接觸性傳染病。FMDV屬于小RNA病毒科（Picornaviridae）口蹄疫病毒屬病毒，有7個血清型，分別稱為O、A、C、SAT1、SAT2、SAT3和亞洲Ⅰ型（Asia1）。FMDV感染細(xì)胞的先決條件是首先與細(xì)胞膜表面的受體結(jié)合，研究表明至少有5種細(xì)胞識別機(jī)制，即

2、細(xì)胞表面的整聯(lián)蛋白avβ1、avβ3、avβ6、avβ8和硫酸乙酰肝素可作為FMDV的受體。 本試驗將含有口蹄疫病毒受體豬源整聯(lián)蛋白β6亞基配體結(jié)合域基因的重組質(zhì)粒B612p，轉(zhuǎn)化到BL21（DE3）宿主菌中，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后制備β6亞基配體結(jié)合域基因目的蛋白，并將其作為抗原免疫BALB/c小鼠，經(jīng)過4次免疫后取其脾細(xì)胞與Sp2/0骨髓瘤細(xì)胞融合。采用有限稀釋法和間接ELISA克隆和篩選陽性雜交瘤細(xì)胞株，利用SDS-PAGE

3、電泳、間接ELISA法、Western blot分析及間接免疫熒光法等方法對制備的單克隆抗體的特異性進(jìn)行鑒定。成功獲得5株能穩(wěn)定傳代并分泌抗β6亞基配體結(jié)合域的雜交瘤細(xì)胞株，分別命名為：C4C7、E7C7、B8C9、C2D8和B786，其分泌的McAb為IgG2b（C2D8）和IgG2a（4C7、E7C7、B8C9、B786）亞類。在此基礎(chǔ)上利用單克隆抗體檢測整聯(lián)蛋白avβ6受體在組織中的表達(dá)分布。 利用pcDNA3．1（+）-

4、β6p真核表達(dá)載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染CHOK1細(xì)胞，間接免疫熒光法檢測整聯(lián)蛋白β6亞基在轉(zhuǎn)染細(xì)胞中的表達(dá)分布。間接免疫組化法和間接免疫熒光法檢測整聯(lián)蛋白avβ6在健康豬舌、唇、氣管等組織中的表達(dá)分布，抗豬源整聯(lián)蛋白B6亞基配體結(jié)合域的單克隆抗體作為一抗，F(xiàn)ITC標(biāo)記山羊抗小鼠IgG、辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG分別作為二抗。結(jié)果表明，pcDNA3．1（+）-β6p真核表達(dá)載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的CHOK1細(xì)胞的細(xì)胞膜及細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可見致密的綠色熒光，豬舌