豬流行性腹瀉單克隆抗體的制備.pdf

1、豬流行性腹瀉（Porcine Epidemic Diarrhea英文縮寫PED）是由豬流行性腹瀉病毒(Porcine Epidemic Diarrhea Virus英文縮寫PEDV)引起的一種豬接觸性腸道傳染疾病，該病的臨床表現(xiàn)為腹瀉，嘔吐，脫水等，其臨床特征類似于豬傳染性腸胃炎。早在1971年于英國(guó)首次爆發(fā)。豬流行性腹瀉以哺乳豬仔豬受到的危害最為嚴(yán)重，感染仔豬致死率可以達(dá)達(dá)到90％以上，潛伏期為5-8天，多發(fā)于冬季。
　　PED

2、V為冠狀病毒科冠狀病毒屬的RNA病毒，由PEDV引起的豬流行性腹瀉在我國(guó)大部分地區(qū)對(duì)養(yǎng)豬行業(yè)造成了不可估量的損失。能找出一種快速準(zhǔn)確的診斷方法診斷出該病對(duì)預(yù)防控制豬流行性腹瀉起到重要的作用。單克隆抗體針對(duì)單一的抗體及位點(diǎn)高度專一，能夠準(zhǔn)確的診斷出疫病。穩(wěn)定、高效的單克隆抗體為找到快速診斷豬流行性腹瀉方法指引方向。能找出若干快捷準(zhǔn)確的判定方法診斷出豬流行性腹瀉病。單克隆抗體對(duì)預(yù)防、控制豬流行性腹瀉起到重要的作用。單克隆抗體對(duì)PEDV的結(jié)構(gòu)

3、功能與基因變異都有重要的指導(dǎo)作用。因此本研究的目的是制取高效，穩(wěn)定的單克隆抗體。試驗(yàn)制備單抗從以下幾個(gè)方面入手:
　　1.PEDV單克隆抗體抗原的增殖與純化
　　單克隆抗體可以在豬病毒性感染疾病的抗原結(jié)構(gòu)功能分析，抗原變異性研究和診斷與控制中起重要作用?；趩慰寡芯慨a(chǎn)生的膠體金更可以快捷，簡(jiǎn)便，高效的對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)。對(duì)PEDV的增殖與純化是能否能成功制備出PEDV的單克隆抗體的基礎(chǔ)環(huán)節(jié)。Vero細(xì)胞為用于本試驗(yàn)擴(kuò)增PEDV的

4、細(xì)胞。接種病毒于Vero細(xì)胞后大約36h左右即可觀察發(fā)現(xiàn)細(xì)胞病變，在Vero細(xì)胞病變到達(dá)90％時(shí)進(jìn)行收集保存。反復(fù)凍融3次以上后，離心取上清液，將上清液高速離心后取沉淀，用PEG法對(duì)所收集的沉淀液進(jìn)行濃縮粗提純。濃縮后即為試驗(yàn)所用的免疫抗原。將純化后的樣品進(jìn)行常規(guī)鑒定，利用RT-PCR和熒光定量PCR鑒定其是否具有免疫反應(yīng)原性。
　　2.PEDV單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株建立
　　經(jīng)方陣滴定法建立了PEDV的間接ELISA檢測(cè)方

5、法。結(jié)果顯示:包被PEDV最適工作濃度為2.0μg/ml，最佳包被溫度為4攝氏度。最佳時(shí)間為12小時(shí)。最適酶結(jié)合物稀釋液為1％BSA-PBST，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(酶標(biāo)二抗)最適稀釋倍數(shù)為1∶4000，作用時(shí)間為30min。
　　將純化過(guò)的PEDV接種于小鼠，每隔7日再進(jìn)行免疫。用間接ELISA方法對(duì)小鼠血清進(jìn)行效價(jià)測(cè)定。可以通過(guò)檢測(cè)大于105的小鼠血清滴度來(lái)進(jìn)行細(xì)胞融合。在融合前第三天，選擇具有最高血清滴度的免疫

6、小鼠并進(jìn)行增強(qiáng)。三天后，將小鼠脾臟免疫，脾細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞融合，觀察狀態(tài)。
　　3.PEDV單克隆抗體腹水的制備
　　將PEDV與PEDV-N蛋白作為篩選抗原，利用有限稀釋法對(duì)陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行亞克隆，再用兩種ELISA法篩選，結(jié)果顯示:選取出3株可穩(wěn)定分泌抗PEDV病毒抗體的雜交瘤細(xì)胞株(3C10、5G8、5F4)。將陽(yáng)性單克隆克隆培養(yǎng)在96孔板中并轉(zhuǎn)移到24孔細(xì)胞板中并轉(zhuǎn)移到6孔細(xì)胞板中，將陽(yáng)生雜交瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移到

7、細(xì)胞瓶?jī)?nèi)以擴(kuò)增培養(yǎng)物。擴(kuò)大培養(yǎng)過(guò)程中，應(yīng)及時(shí)凍存陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞留做備用。通過(guò)腹水誘導(dǎo)法大量制備PEDV的單克隆抗體。
　　對(duì)所得PEDV單克隆抗體進(jìn)行生物學(xué)鑒定，成功獲得1株可穩(wěn)定分泌PEDV抗體的雜交瘤細(xì)胞株(3C10)，單抗3C10的染色體數(shù)目與其他株相比遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出許多;腹水的抗體效價(jià)為1∶7.5×104，濃度為7.55mg/ml。單抗3C10為IgG2b亞類;能夠與PEDV特異性結(jié)合，且僅與結(jié)構(gòu)蛋白N反應(yīng);穩(wěn)定性鑒定結(jié)果表明，