豬CD8β重組蛋白單克隆抗體的制備.pdf

1、CD分子在血細(xì)胞的分化、增殖、活化、遷移以及機(jī)體防御性免疫應(yīng)答、炎癥、凋亡、自身免疫和器官發(fā)生等許多生理和病理過程中發(fā)揮著重要的作用。CD分子和CD mAb作為一種重要的手段和方法，已廣泛地應(yīng)用于生命科學(xué)的研究領(lǐng)域中，包括對(duì)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)理論以及多種疾病的發(fā)病機(jī)制、診斷、預(yù)防和治療等臨床醫(yī)學(xué)的研究。 CD8分子是T淋巴細(xì)胞表面的Ⅰ型跨膜糖蛋白，也是T淋巴細(xì)胞重要的表面標(biāo)志物，它作為粘附分子、輔助受體和免疫調(diào)節(jié)物廣泛參與TCR對(duì)MHCI

2、分子遞呈抗原的識(shí)別和信號(hào)傳遞。CD8分子做為一類信號(hào)傳遞受體，其分子胞質(zhì)部分與非受體型蛋白酪氨酸激酶Src家族p56lck相連，參與TCR介導(dǎo)的信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)。CD8分子包括CD8αα同型二聚體和CD8αβ異型二聚體，CD8同αα型二聚體分子在小鼠腸上皮下與非典型MHCⅠ類分子作用，構(gòu)成腸道免疫屏障。為了解膜蛋白分子在機(jī)體特異性免疫應(yīng)答中的作用及其機(jī)理，本研究進(jìn)行了pCD8β基因的原核表達(dá)和單克隆抗體的制備。 根據(jù)本實(shí)驗(yàn)測(cè)定的pC

3、D8β基因序列和原核表達(dá)載體pET-28a的多克隆酶切位點(diǎn)序列去掉信號(hào)肽設(shè)計(jì)一對(duì)引物，應(yīng)用PCR技術(shù)從重組質(zhì)粒pGEM-T-pCD8β中擴(kuò)增出編碼pCD8β蛋白的基因。PCR產(chǎn)物分離純化后連接到原核表達(dá)載體pET-28a多克隆酶切位點(diǎn)，經(jīng)質(zhì)粒PCR鑒定和EcoRⅠ，HindⅢ雙酶切鑒定，篩選出陽性重組克隆，構(gòu)建成pCD8β基因的原核表達(dá)質(zhì)粒pET-28a-pCD8β。將這種原核表達(dá)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，經(jīng)0．5mmol/L IP

4、TG的誘導(dǎo)在28℃表達(dá)，SDS-PAGE凝膠電泳表明所克隆的基因片段在大腸桿菌中得到表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物是以包涵體的形式存在的重組蛋白pET-28a-pCD8β，且所獲得的重組蛋白分子量約為24Ku，與預(yù)期結(jié)果相符。 通過優(yōu)化原核表達(dá)條件，確定了重組質(zhì)粒pET-28a-pCD8β的原核表達(dá)最佳誘導(dǎo)時(shí)間、溫度和誘導(dǎo)劑濃度，并用優(yōu)化后的條件對(duì)含有pET-28a-pCD8β質(zhì)粒的BL21菌進(jìn)行了大量誘導(dǎo)表達(dá)。使用反復(fù)凍融和超聲方法來裂解表達(dá)

5、菌，利用切膠法純化目的蛋白，用其免疫BALB/c小鼠，經(jīng)過雜交瘤細(xì)胞的建立、融合細(xì)胞的篩選和克隆化培養(yǎng)，成功獲得了一株穩(wěn)定分泌單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，經(jīng)ELISA檢測(cè)分析，用小鼠腹水制備的單克隆抗體的效價(jià)達(dá)1×106； Western-blotting分析證明，此單抗能特異性識(shí)別pCD8β蛋白分子，這為研究豬CD8細(xì)胞及其亞群的組織分布、種類和數(shù)量的動(dòng)態(tài)變化以及細(xì)胞表面標(biāo)志的結(jié)構(gòu)與功能奠定了基礎(chǔ)。 本研究成功地表達(dá)pCD8β基