云南松遺傳圖譜初步構(gòu)建的研究.pdf

1、云南松（Pinusyunnanensis）是云南省主要的用材樹種和分布最廣的鄉(xiāng)土樹種，分布面積占云南森林面積的70％，云南松樹脂含量高，每株在一個產(chǎn)脂季節(jié)平均產(chǎn)脂3-4kg，樹皮中含有鞣質(zhì)，枝、葉、幼果、花粉、樹脂皆可藥用，從而具有很高的經(jīng)濟價值，以前對云南松遺傳改良的研究主要集中在遺傳多樣性、優(yōu)良林分的選擇、種源試驗及選優(yōu)、母樹林改建及子代測定、遺傳增益的研究等，近年來隨著分子標記技術(shù)的發(fā)展，對云南松的研究逐漸從傳統(tǒng)的形態(tài)學和遺傳育種

2、研究過渡到微觀的分子方面的研究，這必將推進林木育種學的工作，為控制重要經(jīng)濟性狀的數(shù)量性狀基因定位和分子標記輔助選擇奠定了基礎(chǔ)。本研究利用ISSR（Inter-simple Sequence RepeatsISSR，簡單序列重復(fù)間區(qū)多態(tài)性）分子標記技術(shù)對云南松同一棵樹上的95顆胚乳進行多態(tài)性分子擴增，并進行遺傳圖譜構(gòu)建的初步研究，為以后的云南松完整的連鎖圖譜的構(gòu)建、分子標記輔助選擇育種、重要基因的克隆與定位提供分子水平上的參考和理論依據(jù)。

3、本研究的主要內(nèi)容如下：
　　 （1）DNA提取：以云南松胚乳為試驗材料進行胚乳基因組DNA的提取，并分別采用CTAB和SDS法提取胚乳DNA，通過瓊脂糖凝膠電泳、紫外分光光度技術(shù)和ISSR-PCR擴增三種方法對所提取的DNA進行檢測、比較DNA的質(zhì)量、產(chǎn)量，結(jié)果表明，兩種方法均能得到高產(chǎn)量的DNA，但CTAB法得到純度低，SDS法提取的DNA產(chǎn)量高、雜質(zhì)少、ISSR-PCR擴增條帶清晰、多態(tài)性好。
　　 （2）ISSR-

4、PCR反應(yīng)體系的建立：通過研究影響ISSR-PCR反應(yīng)體系的主要因子：模板DNA濃度、引物濃度、Mg2+濃度、TaqDNA聚合酶用量、dNTPs濃度、退火溫度對反應(yīng)體系的影響，建立并優(yōu)化了云南松ISSR-PCR反應(yīng)體系：20μLPCR反應(yīng)體積中，buffer（10mmol/L Tris-HCl，50mmol/LKCl，0.1％Triton X-100 pH9.0）2μL，0.4pmol/L-1引物，2.0 mmol/LMgCl2，0.5

5、U TaqDNA聚合酶，0.2 mmol/L dNTPs，30ng模板DNA，引物（GA）8的最適退火溫度為52.5℃。擴增程序為：94℃預(yù)變性5min一個循環(huán)，94℃變性40s，52.5℃（或50℃）退火70s，72℃延伸90s，共35個循環(huán)，最后72℃終延伸10min。
　　 （3）引物的篩選：通過對31條引物初篩和復(fù)篩，共篩選出11個能擴增出清晰、穩(wěn)定并具有多態(tài)性位點的ISSR引物，為別為：P00、P02、P04（退火溫度

6、為50℃），P06、P09、P15、P16、PH1、PH2、PH4、PH5、（退火溫度為52.5℃）。
　　 （4）數(shù)據(jù)采集和統(tǒng)計分析：對所有DNA樣品進行PCR擴增后，經(jīng)凝膠電泳檢測，并用IVP凝膠成像系統(tǒng)拍照分析，記錄時，ISSR標記名稱用引物名加擴增片段的堿基長度表示，在進行多態(tài)性譜帶的判讀時，某一譜帶出現(xiàn)的個體在該位點記為“1”，該譜帶不出現(xiàn)的個體在該位點記為“2”，對于難于判斷的譜帶按缺失數(shù)據(jù)處理，記為“0”，最后用m