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文檔簡介
1、苦瓜(Momordica charantia L.)為葫蘆科苦瓜屬一年生蔓性草本植物,起源于東南亞??喙献鳛樗幨臣嬗玫谋=∈卟耍谖覈戏睫r(nóng)業(yè)生產(chǎn)和人民生活中占有重要地位。苦瓜屬異花授粉作物,具有明顯的雜種優(yōu)勢(shì)。雜交制種時(shí)需綁花做標(biāo)記和套袋隔離,工作量大而繁瑣,在一定程度上制約了苦瓜雜種優(yōu)勢(shì)的利用。以全雌系苦瓜為母本雜交制種雖然具有操作簡便和降低成本等優(yōu)點(diǎn),但是存在由于全雌系苦瓜本身不開雄花導(dǎo)致的自身繁殖困難問題。為了最大限度地提高Ag
2、NO3誘導(dǎo)的全雌系苦瓜自繁率和研究AgNO3誘導(dǎo)花性別分化過程的激素變化和差異基因表達(dá),本文以全雌系苦瓜‘X—黑—d—d’為試材,從形態(tài)、生理和分子水平分析該過程,取得如下結(jié)果:
1.為了最大限度地提高全雌系苦瓜繁殖率,本研究采用不同濃度的AgNO3和不同處理次數(shù)對(duì)不同發(fā)育階段的全雌系苦瓜幼苗進(jìn)行了化學(xué)誘雄試驗(yàn)。結(jié)果表明,在三葉一心到四葉一心期用300 mg/L AgNO3處理2次能成功誘導(dǎo)令雌系苦瓜從第1朵花開始連續(xù)性轉(zhuǎn)
3、化為花粉有活力的兩性花,兩性花平均為11.83朵/株,雄化時(shí)間7.6~8.6天,之后恢復(fù)為全雌花;而且三葉一心期是AgNO3誘導(dǎo)苦瓜雄化的關(guān)鍵時(shí)期。
2.利用cDNA—AFLP技術(shù)研究AgNO3誘導(dǎo)全雌系苦瓜兩性花分化過程差異基因表達(dá)的結(jié)果表明,36對(duì)引物組合共獲得84個(gè)AgNO3處理后增強(qiáng)和特異表達(dá)的轉(zhuǎn)錄本片段(transcript—derived fragments,TDF),約占總條帶數(shù)的2.2%。其中20個(gè)經(jīng)反向N
4、orthern雜交驗(yàn)證,18個(gè)TDF為陽性。經(jīng)克隆、測(cè)序和在線比對(duì),8個(gè)陽性TDF的核苷酸序列在GenBank中與已知功能基因有較高同源性,功能涉及調(diào)節(jié)激素平衡、RNA加工修飾、基因表達(dá)調(diào)控和能量代謝等;2個(gè)陽性TDF核苷酸序列與功能未知蛋白有同源性序列;7個(gè)陽性TDF與已知表達(dá)序列標(biāo)簽有同源序列,但功能未知:1個(gè)陽性TDF無任何同源序列,預(yù)測(cè)是功能未知基因。這些結(jié)果表明AgNO3誘導(dǎo)表達(dá)的這些陽性TDF參與了信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、基因表達(dá)調(diào)控和能
5、量代謝等性別分化過程。
3.為研究AgNO3誘導(dǎo)的全雌系苦瓜兩性花分化與幼葉和花蕾中內(nèi)源激素的關(guān)系,本研究采用酶聯(lián)免疫檢測(cè)技術(shù)(enzyme—linked immunosorbent assays,ELISA)測(cè)定三葉一心期苦瓜噴施蒸餾水和.AgNO3后72h內(nèi)花蕾和新生葉片中內(nèi)源激素含量。結(jié)果顯示,噴施AgNO3后幼葉中IAA、GA3、ZR和ABA含量與噴水的相比,都是先下降后增加。AgNO3處理的花蕾中這4種激素含量在
6、72h內(nèi)沒有一致變化規(guī)律,但變化幅度大于幼葉的,表明生殖器官的內(nèi)源激素對(duì)苦瓜性別分化影響比營養(yǎng)器官的大。AgNO3處理后花蕾中單一激素含量表現(xiàn)出動(dòng)態(tài)平衡。AgNO3處理后24~48h內(nèi),花蕾中這4種激素含量明顯低于噴水的,而其余時(shí)間則高于噴水的,此外,AgNO3處理的花蕾中ABA/IAA、ZR/IAA和GA3/IAA比值也在24~48h發(fā)生劇烈的變化,48h之后這些激素比值與噴水的相差不大,表明AgNO3處理后24~48h是性別分化的關(guān)
7、鍵時(shí)期,IAA可能是AgNO3誘導(dǎo)純雌系苦瓜雄性分化的關(guān)鍵激素。
4.利用RT—PCR(Reverse transcription PCR)和RACE(Rapid—amplification of cDNAends)技術(shù)從全雌系苦瓜花蕾中克隆了一個(gè)cDNA全長為1137bp的ACO基因,命名為Mc—AC01(GenBank登錄號(hào):FJ459813)。該基因包含1005 bp的完整開放閱讀框、45 bp5’端非翻譯區(qū)和Pol
8、y(A)在內(nèi)的87 bp3’端非翻譯區(qū)。完整開放閱讀框推測(cè)編碼334個(gè)氨基酸的蛋白,分子量(MW)為37.30 kDa,等電點(diǎn)(pI)為6.02。BLAST結(jié)果表明,苦瓜Mc—AC01在核苷酸與氨基酸水平上分別和GenBank中其他物種ACO基因同源性達(dá)73%~80%和77%~85%,說明植物.ACO基因在系統(tǒng)進(jìn)化上相對(duì)保守。多序列比較結(jié)果表明,Mc—AC01功能區(qū)域的氨基酸序列較為保守,N—端區(qū)域的差異很大,C—端區(qū)域的差異較?。籑c
9、—AC01含有已報(bào)道植物ACC氧化酶基因的6個(gè)保守區(qū)和7個(gè)二價(jià)鐵離子/抗壞血酸依賴型雙加氧酶家族成員中保守存在的氨基酸殘基,缺失1個(gè)保守區(qū)和2個(gè)保守的二價(jià)鐵離子/抗壞血酸依賴型雙加氧酶家族成員中氨基酸殘基。Mc—AC01在系統(tǒng)進(jìn)化上與雌性系黃瓜雌性分化相關(guān)的Cs—AC03基因聚為一大類,表明Mc—AC01可能是苦瓜雌性分化相關(guān)的ACO基因家族一個(gè)成員。這為進(jìn)一步研究AgNO3誘導(dǎo)全雌系苦瓜兩性花分化與ACC氧化酶基因表達(dá)之間關(guān)系提供了基
10、礎(chǔ)。
5.利用RT—PCR技術(shù)從全雌系苦瓜幼苗花蕾中克隆了一個(gè)cDNA全長為1604 bp的ACS基因,命名為Mc-ACS4(GenBank登錄號(hào):FJ459814)。該序列包含1455 bp的完整開放閱讀框、30 bp5’端非翻譯區(qū)和119 bp3’端非翻譯區(qū)。完整開放閱讀框推測(cè)編碼484個(gè)氨基酸的蛋白,分子量(MW)為54.02 kDa,等電點(diǎn)(pI)為6.23。BLAST結(jié)果表明,苦瓜.Mc—ACS4在核苷酸與氨基酸
11、水平上分別和GenBank中植物ACS基因同源性達(dá)73%~99%和64%~99%,說明植物ACS基因在系統(tǒng)進(jìn)化上相對(duì)保守??喙螹c—ACS4與苦瓜Mc—ACS3基因僅存在2個(gè)氨基酸差異,同源性高達(dá)99%。多序列比較結(jié)果表明,Mc—ACS4功能區(qū)域的氨基酸序列保守度高,N—端區(qū)域的差異較小,C—端區(qū)域的差異很大;Mc—ACS4含有已報(bào)道的ACC合成酶基因有7個(gè)保守區(qū)和11個(gè)保守氨基酸殘基。Mc—ACS4在系統(tǒng)進(jìn)化上與乙烯誘導(dǎo)冬瓜表達(dá)的AC
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