辣椒根腐疫病抗性基因的標記加密及候選基因分析.pdf

1、由辣椒疫霉菌（Phytophthora capsici）引起的辣椒疫病（Phytophthora blight）是一種毀滅性的土傳病害，在世界范圍內傳播，是導致辣椒減產的主要因素之一。廣東地區(qū)由于高溫高濕氣候條件的影響，辣椒疫病尤為嚴重，一旦爆發(fā)，就能導致辣椒大面積絕收。辣椒疫病根據病原菌侵染部位的不同分為根腐（root rot）、果腐、（fruit rot）莖枯（stem blight）和葉枯（foliar blight）等不同癥狀，

2、其中，辣椒根腐疫?。≒hytophthoraroot rot）的發(fā)生通常直接導致植株不可逆死亡，對辣椒生產的損害最為嚴重。國內外學者研究結果表明根腐疫病的抗性遺傳機制從廣義上可分為2種類型，分別為數量抗性和特異抗性。數量抗性表現為多基因控制，目前多項研究結果鑒定并定位的主效根腐疫病抗性基因位于辣椒第5號染色體；特異抗性為單基因控制，表現為對某種或少數幾個特定生理小種具有完全抗性，而對其它生理小種不具有抗性。目前為止，國內外還未見根腐疫病

3、特異抗性基因定位的報道。
　　前期，本課題組從國外引進國際公認辣椒抗疫病材料CM334和高世代純合感病材料 NMCA10399，對根腐疫病抗性遺傳規(guī)律的研究結果表明：在廣東省辣椒疫霉菌優(yōu)勢生理小種 Byl4（Race3）侵染下，根腐疫病抗性性狀為顯性單基因控制（李智軍等2008）。隨后，基于SLAF-seq技術將抗性基因定位在辣椒第10號染色體末端約2.6 Mb區(qū)域內。本試驗在此基礎上利用BC1F1群體，并加密標記篩選重組株，進一

4、步將抗性基因限定在1.5Mb的物理距離內，接下來對該區(qū)域內基因進行生物信息學分析，并在辣椒疫霉菌脅迫條件下對預測到的抗病相關基因進行基因表達分析，尋找差異表達基因；另外，本試驗還對10個常用內參基因的穩(wěn)定性進行了評價，篩選出了辣椒疫霉菌脅迫條件下最適合用于辣椒RT-qPCR的內參基因。主要結論如下：
　　1、在前期研究基礎上，在2.6 Mb區(qū)間內篩選到SSR多態(tài)標記P52-11-34，利用該標記及其它10個現有的連鎖標記分析122

5、株BC1F1群體的基因型，并結合Byl4菌株灌根接種后的表型調查，將根腐疫病抗性基因進一步定位在標記 P52-11-34和P52-11-41之間約1.5 Mb的范圍內，與兩側相鄰標記的遺傳距離分別為0.3 cM和1.1 cM。
　　2、選擇了10個常用內參基因（ACT、UBI-1、GAPDH、UBI-3、EIF5A2、β-TUB、α-TUB、EF1-α、UBQ、TEF1α），以 CM334和NMCA10399在疫霉菌處理及無菌水處

6、理后不同時間點（0 h、12 h、24 h、36 h、48 h）所取幼苗根部的cDNA為模版，利用RT-qPCR方法分析了這10個基因表達差異，并通過geNorm、NormFinder和BestKeeper三個軟件進行內參穩(wěn)定分析，最終確定EF1-α為疫霉菌脅迫條件下表達最穩(wěn)定的內參基因。
　　3、對定位區(qū)段內基因進行生物信息學分析，共預測到94個基因，其中有26個抗病相關基因。在疫霉菌灌根接種后不同時間點（0 h、12 h、24

7、 h、36 h、48 h）取CM334和NMCA10399幼苗根部，以其cDNA為模版，以無菌水處理為對照，EF1-α為內參，通過RT-qPCR對26個抗病相關基因進行表達分析，結果表明，在26個抗病相關基因中，有8個基因（CA10g20770、CA10g20470、CA10g20540、CA10g20570、CA10g20630、CA10g20740、CA10g20750和CA10g21040）在抗病材料CM334接菌處理后表達量上調