利用VIGS對辣椒抗疫病候選基因Ca21394的功能分析.pdf

1、辣椒（Capsicum annuum L.）是一種受人們喜愛的蔬菜，在全世界范圍內(nèi)廣泛種植。辣椒疫病由辣椒疫霉菌(Phyiophthora capsici)引起，在辣椒的整個生長階段都有可能發(fā)生，可導(dǎo)致成片辣椒死亡，嚴(yán)重影響了辣椒的生產(chǎn)。實踐證明，明確作物的抗病基因并用于選育抗病品種，才能從根本上預(yù)防某種病害的發(fā)生。本實驗室前期研究結(jié)果顯示，Ca21394為辣椒抗疫病的候選基因，但未進行功能驗證;病毒誘導(dǎo)的基因沉默(VIGS)是一種快速

2、沉默目的基因的方法，正在越來越多地用于植物候選基因的功能分析。本研究以辣椒抗疫病材料‘G43’為試驗材料，利用VIGS技術(shù)，分析Ca21394是否參與辣椒對辣椒疫霉菌的抗性反應(yīng)。研究結(jié)果如下:
　　構(gòu)建了VIGS重組載體pTRV2∶Ca21394。采用對寄主影響較溫和的煙草脆裂病毒(TRV)為病毒載體，以辣椒葉片DNA為模板，在Ca21394基因序列5’端的一個外顯子區(qū)域內(nèi)設(shè)計引物，克隆得到大小為438 bp的目的片段，經(jīng)過雙酶切

3、檢測、測序驗證序列正確后，在pTRV2載體的XbaⅠ和BamHⅠ雙酶切位點間插入該目的片段，完成pTRV2∶Ca21394重組載體的構(gòu)建，并通過熱激轉(zhuǎn)化方法將重組載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌GV3101(Agrobacterium tumefaciens)。
　　優(yōu)化了農(nóng)桿菌接種辣椒的方法。采用VIGS重組載體茵液侵染植株前，需要進行凍存菌液活化、LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)、誘導(dǎo)培養(yǎng)基(IM)培養(yǎng)。試驗以八氫番茄紅素脫氫酶基因(PDS)的重組載

4、體pTRV2∶PDS為材料，研究根癌農(nóng)桿菌GV3101的中菌液OD600值和培養(yǎng)時間的關(guān)系。當(dāng)LB液體培養(yǎng)基菌液濃度OD600值為1.15時，可以較快得到IM培養(yǎng)所需菌液的濃度(OD600=0.50)。試驗為利用LB液體培養(yǎng)基或IM培養(yǎng)農(nóng)桿菌估算培養(yǎng)時間提供了參考，從而減少了農(nóng)桿菌培養(yǎng)過程中的菌液濃度的檢測次數(shù)。
　　鑒定了候選基因Ca21394與抗疫病的相關(guān)性。在抗疫病辣椒材料‘G43’上接種pTRV2∶Ca21394重組載體農(nóng)

5、桿菌菌液，待接種pTRV2∶PDS的植株出現(xiàn)白化癥狀時，接種辣椒疫霉菌。植株葉片實時定量RT-PCR檢測結(jié)果顯示，接種pTRV2∶Ca21394植株葉片中Ca21394的表達量下降，其中4＃植株沉默效率最高為72％，植株發(fā)病癥狀明顯。離體葉片接種疫霉菌顯示，未接種農(nóng)桿菌葉片(WT)無明顯發(fā)病癥狀，接種空載體(pTRV2∶00)的葉片發(fā)病比較輕，而沉默Ca21394基因（接種pTRV2∶Ca21394）的葉片發(fā)病比較嚴(yán)重，接種4d后病斑布