甘藍型油菜硼高效近等基因系的構建及硼高效基因BnBE2的定位.pdf

1、硼是高等植物生長發(fā)育所必需的礦質(zhì)元素。甘藍型油菜是需硼較多的作物，對硼缺乏比較敏感。我國油菜主產(chǎn)區(qū)土壤普遍缺硼，缺硼導致油菜“花而不實”，大量減產(chǎn)。農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上主要依賴增施硼肥解決耕地缺硼問題，然而硼是不可再生的礦質(zhì)資源。不同甘藍型油菜品種的硼效率性狀存在顯著差異，而且受遺傳控制，這為硼效率性狀的遺傳改良提供基礎。我們課題組在篩選獲得甘藍型油菜硼效率種質(zhì)資源的基礎上，開展硼高效基因的初步定位工作，研究表明甘藍型油菜硼效率受多個基因控制。為

2、了精細定位和克隆甘藍型油菜硼高效基因，本論文建立了營養(yǎng)液培養(yǎng)條件下甘藍型油菜苗期硼效率的鑒定體系，以甘藍型油菜苗期硼效率性狀為基礎，采用隨機的分子標記輔助背景選擇構建了硼高效近等基因系；并在此基礎上開展了硼高效位點BnBE2的定位研究，主要獲得以下結果： 1.甘藍型油菜苗期硼效率鑒定體系的建立 在不同硼水平的營養(yǎng)液培養(yǎng)條件下，調(diào)查不同基因型甘藍型油菜苗期的生長勢，結果表明在大量和微量元素分別采用優(yōu)級純和分析純化學試劑、營

3、養(yǎng)液母液和工作液均用去離子水配制(>12MΩ)時，在0.25μMB水平下不同基因型甘藍型油菜的生長勢表現(xiàn)出明顯的差異，硼高效基因型生長較好，而硼低效基因型植株矮小且表現(xiàn)出明顯的缺硼癥狀。該鑒定體系不但適合不同基因型甘藍型油菜品種苗期硼效率的鑒定，也適合分離群體各單株硼效率差異的研究，其實驗條件易控制，重復性好。 2.甘藍型油菜硼高效近等基因系的構建 在營養(yǎng)液培養(yǎng)條件下(0.25μMB)，通過連續(xù)四代回交，且在每一回交世代

4、的苗期進行硼效率鑒定，采用分子標記對回交世代中硼高效單株進行遺傳背景輔助選擇，構建了甘藍型油菜硼高效近等基因系。并證明在回交過程中采用隨機分子標記輔助背景選擇的有效性和必要性，且適宜在回交早世代進行。 3.硼高效基因的定位 3.1回交群體中硼效率性狀的遺傳分析 采用營養(yǎng)液培養(yǎng)(0.25μMB)對回交分離群體苗期硼效率性狀進行調(diào)查，根據(jù)I18株系的BC4S1，BC5和BC6三個回交分離群體中高、低效單株的分離比例，

5、表明I18株系的硼效率性狀受單個孟德爾因子控制。該株系中目標位點純合的單株與輪回親本組成了一對硼高效近等基因系，可供開展硼高效基因的精細定位和克隆、以及硼高效位點生理功能等的研究。 3.2硼高效基因連鎖標記的篩選與定位 在I18株系的BC5回交群體苗期硼效率鑒定的基礎上，以極端硼效率表型分組構建了近等基因池，結合AFLP和SRAP分子標記技術，篩選到6個與目標基因連鎖的分子標記。利用BC6、TNDH和BQDH兩個雙單倍體

6、遺傳群體對連鎖標記進行定位，結果表明目標基因位于甘藍型油菜N14連鎖群上，該硼高效位點被命名為BnBE2。對這些連鎖的分子標記進行測序并與Brassica數(shù)據(jù)庫中的序列進行BLAST分析，發(fā)現(xiàn)與連鎖標記序列高度同源的克隆均來自甘藍(Brassicaoleracea)，從側面證明了本實驗定位結果的可靠性。 3.3連鎖的AFLP標記向SSCP標記的轉化 將與目標基因連鎖的AFLP標記S6M32的序列在Brassica數(shù)據(jù)庫進

7、行比對，發(fā)現(xiàn)它與甘藍的一個BAC克隆BOHZW41高度同源，根據(jù)目標片段的側翼序列設計引物，將該AFLP標記成功地轉化為SSCP標記；證明了該轉化標記方法的可行性。通過對該SSCP標記的片段測序并采用軟件RNAstructure3.2對該SSCP標記的序列進行二級結構預測，發(fā)現(xiàn)兩個親本之間因為3個堿基的差異導致了構象的改變，并揭示了產(chǎn)生該SSCP標記的理論依據(jù)。 3.4利用比較作圖發(fā)展連鎖標記 甘藍型油菜的基因組由A、C

8、基因組組成，分別起源于白菜和甘藍，且甘藍與白菜基因組間序列具有高度同源性，將不同親本構建的甘藍型油菜遺傳圖譜A4上的3個SSR標記定位在C4上，且與目標基因BnBE2連鎖。 4.硼高效基因BnBE2的生理功能 比較I18株系的硼高效回交單株(BC4S1,BC5)以及硼高效親本青油10號和硼低效親本Bakow在0.25μMB水平條件下硼吸收累積、生物學產(chǎn)量等性狀，推測該株系硼高效QTL位點的硼高效生理基礎可能為硼利用高效。