甘藍(lán)型油菜硼高效近等基因系的構(gòu)建及硼高效基因BnBE2的定位.pdf

1、硼是高等植物生長(zhǎng)發(fā)育所必需的礦質(zhì)元素。甘藍(lán)型油菜是需硼較多的作物，對(duì)硼缺乏比較敏感。我國(guó)油菜主產(chǎn)區(qū)土壤普遍缺硼，缺硼導(dǎo)致油菜“花而不實(shí)”，大量減產(chǎn)。農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上主要依賴增施硼肥解決耕地缺硼問(wèn)題，然而硼是不可再生的礦質(zhì)資源。不同甘藍(lán)型油菜品種的硼效率性狀存在顯著差異，而且受遺傳控制，這為硼效率性狀的遺傳改良提供基礎(chǔ)。我們課題組在篩選獲得甘藍(lán)型油菜硼效率種質(zhì)資源的基礎(chǔ)上，開(kāi)展硼高效基因的初步定位工作，研究表明甘藍(lán)型油菜硼效率受多個(gè)基因控制。為

2、了精細(xì)定位和克隆甘藍(lán)型油菜硼高效基因，本論文建立了營(yíng)養(yǎng)液培養(yǎng)條件下甘藍(lán)型油菜苗期硼效率的鑒定體系，以甘藍(lán)型油菜苗期硼效率性狀為基礎(chǔ)，采用隨機(jī)的分子標(biāo)記輔助背景選擇構(gòu)建了硼高效近等基因系；并在此基礎(chǔ)上開(kāi)展了硼高效位點(diǎn)BnBE2的定位研究，主要獲得以下結(jié)果： 1.甘藍(lán)型油菜苗期硼效率鑒定體系的建立 在不同硼水平的營(yíng)養(yǎng)液培養(yǎng)條件下，調(diào)查不同基因型甘藍(lán)型油菜苗期的生長(zhǎng)勢(shì)，結(jié)果表明在大量和微量元素分別采用優(yōu)級(jí)純和分析純化學(xué)試劑、營(yíng)

3、養(yǎng)液母液和工作液均用去離子水配制(>12MΩ)時(shí)，在0.25μMB水平下不同基因型甘藍(lán)型油菜的生長(zhǎng)勢(shì)表現(xiàn)出明顯的差異，硼高效基因型生長(zhǎng)較好，而硼低效基因型植株矮小且表現(xiàn)出明顯的缺硼癥狀。該鑒定體系不但適合不同基因型甘藍(lán)型油菜品種苗期硼效率的鑒定，也適合分離群體各單株硼效率差異的研究，其實(shí)驗(yàn)條件易控制，重復(fù)性好。 2.甘藍(lán)型油菜硼高效近等基因系的構(gòu)建 在營(yíng)養(yǎng)液培養(yǎng)條件下(0.25μMB)，通過(guò)連續(xù)四代回交，且在每一回交世代

4、的苗期進(jìn)行硼效率鑒定，采用分子標(biāo)記對(duì)回交世代中硼高效單株進(jìn)行遺傳背景輔助選擇，構(gòu)建了甘藍(lán)型油菜硼高效近等基因系。并證明在回交過(guò)程中采用隨機(jī)分子標(biāo)記輔助背景選擇的有效性和必要性，且適宜在回交早世代進(jìn)行。 3.硼高效基因的定位 3.1回交群體中硼效率性狀的遺傳分析 采用營(yíng)養(yǎng)液培養(yǎng)(0.25μMB)對(duì)回交分離群體苗期硼效率性狀進(jìn)行調(diào)查，根據(jù)I18株系的BC4S1，BC5和BC6三個(gè)回交分離群體中高、低效單株的分離比例，

5、表明I18株系的硼效率性狀受單個(gè)孟德?tīng)栆蜃涌刂?。該株系中目?biāo)位點(diǎn)純合的單株與輪回親本組成了一對(duì)硼高效近等基因系，可供開(kāi)展硼高效基因的精細(xì)定位和克隆、以及硼高效位點(diǎn)生理功能等的研究。 3.2硼高效基因連鎖標(biāo)記的篩選與定位 在I18株系的BC5回交群體苗期硼效率鑒定的基礎(chǔ)上，以極端硼效率表型分組構(gòu)建了近等基因池，結(jié)合AFLP和SRAP分子標(biāo)記技術(shù)，篩選到6個(gè)與目標(biāo)基因連鎖的分子標(biāo)記。利用BC6、TNDH和BQDH兩個(gè)雙單倍體

6、遺傳群體對(duì)連鎖標(biāo)記進(jìn)行定位，結(jié)果表明目標(biāo)基因位于甘藍(lán)型油菜N14連鎖群上，該硼高效位點(diǎn)被命名為BnBE2。對(duì)這些連鎖的分子標(biāo)記進(jìn)行測(cè)序并與Brassica數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列進(jìn)行BLAST分析，發(fā)現(xiàn)與連鎖標(biāo)記序列高度同源的克隆均來(lái)自甘藍(lán)(Brassicaoleracea)，從側(cè)面證明了本實(shí)驗(yàn)定位結(jié)果的可靠性。 3.3連鎖的AFLP標(biāo)記向SSCP標(biāo)記的轉(zhuǎn)化 將與目標(biāo)基因連鎖的AFLP標(biāo)記S6M32的序列在Brassica數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)

7、行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)它與甘藍(lán)的一個(gè)BAC克隆BOHZW41高度同源，根據(jù)目標(biāo)片段的側(cè)翼序列設(shè)計(jì)引物，將該AFLP標(biāo)記成功地轉(zhuǎn)化為SSCP標(biāo)記；證明了該轉(zhuǎn)化標(biāo)記方法的可行性。通過(guò)對(duì)該SSCP標(biāo)記的片段測(cè)序并采用軟件RNAstructure3.2對(duì)該SSCP標(biāo)記的序列進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)兩個(gè)親本之間因?yàn)?個(gè)堿基的差異導(dǎo)致了構(gòu)象的改變，并揭示了產(chǎn)生該SSCP標(biāo)記的理論依據(jù)。 3.4利用比較作圖發(fā)展連鎖標(biāo)記 甘藍(lán)型油菜的基因組由A、C

8、基因組組成，分別起源于白菜和甘藍(lán)，且甘藍(lán)與白菜基因組間序列具有高度同源性，將不同親本構(gòu)建的甘藍(lán)型油菜遺傳圖譜A4上的3個(gè)SSR標(biāo)記定位在C4上，且與目標(biāo)基因BnBE2連鎖。 4.硼高效基因BnBE2的生理功能 比較I18株系的硼高效回交單株(BC4S1,BC5)以及硼高效親本青油10號(hào)和硼低效親本Bakow在0.25μMB水平條件下硼吸收累積、生物學(xué)產(chǎn)量等性狀，推測(cè)該株系硼高效QTL位點(diǎn)的硼高效生理基礎(chǔ)可能為硼利用高效。