甘藍(lán)型油菜硼轉(zhuǎn)運(yùn)子基因的克隆、表達(dá)和分子進(jìn)化.pdf

1、硼是植物生長(zhǎng)發(fā)育必需的微量營養(yǎng)元素之一。油菜在我國是繼水稻、小麥、玉米、大豆之后的第五大作物,是我國的主要油料作物之一。甘藍(lán)型油菜是需硼較多的作物,對(duì)缺硼敏感。缺硼影響營養(yǎng)生長(zhǎng)和生殖生長(zhǎng),導(dǎo)致甘藍(lán)型油菜植株矮小,“花而不實(shí)”,從而造成產(chǎn)量的大量減產(chǎn)。在我國,油菜的主產(chǎn)區(qū)位于長(zhǎng)江中下游,其總產(chǎn)量占全國的80％以上,而這一地區(qū)的土壤普遍缺硼。不同甘藍(lán)型油菜品種的硼吸收利用效率存在顯著差異,而且受基因控制,這為硼效率性狀的遺傳改良提供了基礎(chǔ)。

2、硼轉(zhuǎn)運(yùn)子廣泛存在于高等植物中,負(fù)責(zé)硼在植物體內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn),在植物缺硼脅迫和高硼毒害時(shí)發(fā)揮重要的作用。我們課題組在篩選獲得甘藍(lán)型油菜硼高效和低效品種的基礎(chǔ)上,已經(jīng)開展了硼高效的生理機(jī)制和硼高效QTLs的研究。為了明確甘藍(lán)型油菜中硼轉(zhuǎn)運(yùn)子與硼高效吸收轉(zhuǎn)運(yùn)的關(guān)系,本文研究了硼高、低效品種苗期硼吸收轉(zhuǎn)運(yùn)的差異,在甘藍(lán)型油菜中克隆了硼轉(zhuǎn)運(yùn)子基因BnBOR1,分析了這些基因的分子進(jìn)化和表達(dá)模式,探討了硼轉(zhuǎn)運(yùn)子基因與硼相關(guān)QTLs之間關(guān)系。獲得以下主要結(jié)

3、果:
　　 1.不同硼處理下,甘藍(lán)型油菜硼高、低效品種的生理差異營養(yǎng)液培養(yǎng)條件下,調(diào)查了硼高效品種青油10號(hào)和硼低效品種Westar在不同硼水平下的干重、根長(zhǎng)、硼累積量和硼轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)。結(jié)果表明,在缺硼(0.25μM)條件下,硼高效品種(青油10號(hào))生長(zhǎng)較好,而硼低效品種(Westar)對(duì)缺硼敏感,生長(zhǎng)明顯受阻。硼高效品種的硼轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)(地上部和根部硼累積量的比值)高于硼低效品種,即硼高效品種具有較高的硼轉(zhuǎn)運(yùn)能力。
　　 2.

4、硼轉(zhuǎn)運(yùn)子基因的克隆及其結(jié)構(gòu)特征利用同源克隆法,采用RACE技術(shù),在甘藍(lán)型油菜中分離克隆了6個(gè)硼轉(zhuǎn)運(yùn)子基因,分別命名為:BnBOR1;1a、BnBOR1;1c、BnBOR1；2a、BnBOR1；2c、BnBOR1；3a和BnBOR1；3c。Southern雜交和基因克隆的結(jié)果表明,甘藍(lán)型油菜BnBOR1基因家族很可能僅存在6個(gè)BnBOR1基因。
　　 BnBOR1存在內(nèi)含子保留和競(jìng)爭(zhēng)性剪切的方式,在其3’端還存在豐富的可變加尾位點(diǎn)

5、。BnBOR1；1a在轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)TATA box和5’端非翻譯區(qū)之間有一個(gè)33 bp的反向重復(fù)序列,這可能是一個(gè)蕓薹族特異的新近產(chǎn)生的MITE-like結(jié)構(gòu)。BnBOR1;1a、BnBORJ1；1c、BnBOR1；2a和BnBOR1；2c丟失了兩個(gè)內(nèi)含子。
　　 3.硼轉(zhuǎn)運(yùn)子基因的分子進(jìn)化對(duì)蕓薹科BORJ1基因系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明,甘藍(lán)型油菜BnBORJ1為擬南芥AtBOR1的直系同源基因,它們一起形成蕓薹科BOR1基因家族。6

6、個(gè)BnBOR1基因可分為3個(gè)組,每組包括2個(gè)基因,一個(gè)來源于A基因組,另一個(gè)來源于C基因組。其中,BnBOR1；1a和BnBOR1；1c為第一組(GroupⅠ)；BnBOR1；2a和BnBOR1；2c為第二組(GroupⅡ)；BnBOR1；3a和BnBOR1；3c為第三組(GroupⅢ),并且,第一組和第二組的親緣關(guān)系比它們與第三組的親緣關(guān)系更近。其中,BnBOR1；1a、BnBOR1；2a和BnBOR1；3a來自于A基因組,另外3個(gè)基

7、因來自于C基因組。6個(gè)BnBOR1基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹證實(shí)了蕓薹族物種三倍化和甘藍(lán)型油菜的異源二倍化理論,說明BnBOR1基因的形成反映了蕓薹族基因組進(jìn)化過程中的三倍化事件。在此基礎(chǔ)上,我們提出假說,認(rèn)為蕓薹族的三倍化不是一次加倍過程形成的,而是由一個(gè)同源四倍化和一個(gè)異源二倍化兩個(gè)過程綜合作用的結(jié)果。
　　 BnBORJ1密碼子存在一定的偏愛性,但成員之間差異不顯著?；蚓幋a序列的Ka/Ks值為0.0249-0.0978,遠(yuǎn)小于1,

8、說明在基因進(jìn)化過程中受到了強(qiáng)烈的純化選擇。用PAML4.4中M8模型的BEB分析BnBOR1,檢測(cè)到了6個(gè)可能受正向選擇的氨基酸位點(diǎn),其中L700位點(diǎn)的概率達(dá)到了顯著水平。另外,M2(雙速率)和M0(單速率)模型檢測(cè)到BnBOR1；3a和BnBOR1；3c受到相對(duì)較小的選擇壓力。
　　 4.硼轉(zhuǎn)運(yùn)子基因的表達(dá)Northern雜交結(jié)果表明,在甘藍(lán)型油菜的苗期,BnBOR1主要在根部表達(dá)；與擬南芥AtBOR1的轉(zhuǎn)錄水平不受硼誘導(dǎo)不同

9、,其在根部明顯受缺硼誘導(dǎo)上升表達(dá)。大田試驗(yàn)中,用半定量RT-PCR方法檢測(cè)硼高效品種青油10和硼低效品種Westar不同器官在硼正常和缺硼條件下BnBOR1基因的表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn),BnBOR1基因家族成員的表達(dá)存在組織特異性的分化。BnBOR1；3a和BnBOR1；3c在所有的部位(根、莖、葉、花、蕾和長(zhǎng)角果)都檢測(cè)到表達(dá),而其余四個(gè)基因僅在根、莖和花中有一定的表達(dá)。在缺硼條件下,BnBOR1；1c、BnBOR1；2a和BnBOR1；2c

10、的表達(dá)受缺硼誘導(dǎo)顯著的上升。硼高效品種青油10號(hào)和硼低效品種Westar之間,BnBOR1基因表達(dá)存在明顯的差異。無論在正常還是缺硼條件下,BnBOR1；1c在硼高效品種QY10中的表達(dá)都要顯著的高于硼低效品種Westar。在甘藍(lán)型油菜的花中,硼高效品種QY10所有BnBOR1基因的表達(dá)要明顯的高于硼低效品種Westar。
　　 5.硼轉(zhuǎn)運(yùn)子基因在甘藍(lán)型油菜遺傳連鎖圖譜上的定位在甘藍(lán)型油菜TN遺傳連鎖圖譜上定位兩個(gè)硼轉(zhuǎn)運(yùn)子基因B