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文檔簡介
1、銅是有機體生長所必需的元素,但在越來越多的農業(yè)生產和工業(yè)應用中銅已經成為環(huán)境污染的只要來源之一。過量的銅會誘導植物和綠藻產生過量的活性氧,進而影響植物和綠藻的生長與代謝;為了應對銅脅迫有機體會產生一些對抗機制,其中之一就是積累大量脯氨酸。盡管如此,銅脅迫下植物和綠藻的生理生化過程尚知之甚少。一氧化氮(NO)作為信號分子能夠介導多種生物和非生物脅迫誘導的生理反應。本文研究了萊茵衣藻內銅誘導的NO的產生與脯氨酸合成之間的關系,結果顯示,被測
2、試藻暴露在低銅濃度下(2.5 and5.0μM Cu2+)積累了大量的脯氨酸。同時還觀察到隨著供銅濃度的增加細胞內外NO的濃度也伴隨著相應的增多。數據分析表明萊茵衣藻在銅脅迫下內源NO的產生與脯氨酸水平的變化成正相關。通過分別添加NO特殊供體SNP與NO捕獲劑cPTIO確定NO參與脯氨酸的積累。銅處理的藻細胞經10μM SNP預處理后其脯氨酸的積累增加了1.5倍,同時添加10μM cPTIO能阻止這種影響。進一步研究銅和NO對脯氨酸合成
3、中的關鍵酶△1-吡咯啉-5-羧酸合成酶(P5CS,EC2.7.2.11)活性與轉錄量的影響,發(fā)現銅處理的衣藻中SNP的應用能激發(fā)P5CS的活性并上游調控P5CS基因的表達,相反,cPTIO卻能抑制這種現象。這些結果顯示萊茵衣藻內銅脅迫響應的脯氨酸合成與NO的產生密切相關,進而表明NO在重金屬銅脅迫下脯氨酸代謝中的調控作用。
鐵同樣是植物和綠色藻類生長所必需的營養(yǎng)元素,但是由于外界Fe(Ⅲ)的不可利用性及植物和綠藻對鐵吸收效
4、率普遍不高,導致植物與綠藻經常出現缺鐵癥狀,即萎黃癥。因此怎樣調控這一生理病癥是個亟待解決的問題。CO是動物體內的內生性氣體分子并調控一系列的生理生化進程,但是CO是否也調控植物與微藻體內的營養(yǎng)脅迫響應則研究甚少。本文研究了缺鐵狀態(tài)下萊茵衣藻細胞內CO對鐵平衡的調控。發(fā)現8μM的外源性CO能夠阻止缺鐵引起的萎黃癥并能提高細胞葉綠素的積累,使衣藻恢復綠色,并且衣藻葉綠體片層結構也在加入外源CO后清晰可見。而CO更能上游調控缺鐵狀態(tài)下衣藻細
5、胞中FTR1,Fd, FOX1等與鐵吸收轉運相關的基因的表達。外源性CO還能夠提高缺鐵細胞的鐵含量。
胞內CO的產生與血紅素氧化酶heme oxygenase1(HO-1,EC1.14.99.3)密切相關。血紅素氧化酶能夠催化血紅素分解成CO,亞鐵離子和膽綠素。研究表明缺鐵誘導萊茵衣藻內HO-1基因的表達,說明內源CO可能參與萊茵衣藻缺鐵響應過程。我們測定了缺鐵狀態(tài)下HO-1,FOX1等酶的活性,發(fā)現這些酶活性都被誘導提高
6、。
為了更深入地證明HO-1及CO緩解缺鐵脅迫的作用,我們構建了萊茵衣藻HO-1過表達載體,和作為對比的HO-1敲除載體,并先后獲得能夠穩(wěn)定遺傳的轉化子。對缺鐵狀態(tài)下的轉基因衣藻進行一系列生理生化及分子功能鑒定后,發(fā)現HO-1過表達藻株能夠完全抑制失綠現象,且包括HO-1在內的一些關鍵基因都能高效表達,酶活測定也顯示HO-1與FOX1酶活力增加。透射電鏡觀察發(fā)現HO-1過表達藻體的葉綠體片層結構在鐵缺乏情況下始終清晰可見,
7、與正常藻細胞差別不大。而HO-1敲除轉化子不能使藻細胞恢復綠色,葉綠素片層結構也不完整并遭到嚴重破壞。
進一步研究發(fā)現,添加外源性CO后正常生長的萊茵衣藻在鐵缺乏狀態(tài)下細胞內的NO水平有所提高;同樣的HO-1轉基因衣藻在缺鐵條件下其細胞內的NO水平也顯著提高,這兩種現象都能夠通過添加NO捕獲劑cPTIO得到逆轉,說明CO的調控作用需要NO的參與并有可能受到NO的上游調控。本研究表明CO能夠提高萊茵衣藻對缺鐵的耐受性,并在缺
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