三種檢測(cè)ampc酶方法的比較

1、<p>　　三種檢測(cè)AmpC酶方法的比較</p><p>　　作者：陳林珍，李曉穗，劉一鳴，鄒燕 </p><p>　　【關(guān)鍵詞】 表型篩選法 </p><p>　　摘要:目的 采用三維試驗(yàn)、表型篩選法及頭孢西丁紙片藥敏法(K-B法)同時(shí)檢測(cè)腸道G-桿菌的AmpC酶，并加以比較，找出一種適合臨床常規(guī)應(yīng)用的檢測(cè)AmpC酶的方法。方法 用頭孢硝噻吩法檢測(cè)出9

2、7株β內(nèi)酰胺酶陽(yáng)性的腸道G-桿菌作為試驗(yàn)待測(cè)菌，用頭孢西丁藥敏法、表型篩選法測(cè)定細(xì)菌耐藥情況，以判斷產(chǎn)AmpC酶的情況。用三維分析法測(cè)定細(xì)菌粗提物中的AmpC酶情況。 結(jié)果 97株腸道桿菌頭孢西丁藥敏法結(jié)果顯示產(chǎn)AmpC酶共有36 株，占37.1%（36 /97），與三維試驗(yàn)比較總符合率為74.2%。表型篩選法產(chǎn)AmpC酶的菌株有15株，占15.5%（15/97），與三維試驗(yàn)比較總符合率為91.8 %。結(jié)論 表型篩選法與三維試驗(yàn)法比較差

3、異無(wú)顯著性。表型篩選法可以作為一種臨床快速、簡(jiǎn)便、可靠的檢測(cè)AmpC酶的方法。 </p><p>　　關(guān)鍵詞:頭孢西丁藥敏法；三維試驗(yàn)；表型篩選法；AmpC酶 </p><p>　　Abstract: Objective using three dimensional taest,phenotype screening taest and Cefoxitin sensitive test

4、to detect AmpC enzyme of intestinal G- Bacillus,then compare and set up a new convenient routine method in clinical laboratoies. Methods Using nitrocefin test 97 βlactams nezymes(+)intestinal Bacillus as test.Cefoxitin

5、sensitive test and phenotype screening were performened to detect the resistance in 97 intestinal Bacillus.The three dismensional tests was performened to detect the AmpC enzy</p><p>　　Key words:cefoxitin se

6、nsitive test; three dismensional tests; phenotype screening; AmpC enzymes </p><p>　　AmpC β內(nèi)酰胺酶(簡(jiǎn)稱AmpC酶)是由腸桿菌科細(xì)菌或/和綠膿假單胞菌的染色體或質(zhì)粒介導(dǎo)產(chǎn)生的一類作用于頭孢菌素、且不被克拉維酸所抑制的β內(nèi)酰胺酶，故AmpC酶又稱作為頭孢菌素酶［1,2］。隨著β內(nèi)酰胺類抗生素、尤其是頭孢菌素的廣泛應(yīng)用，產(chǎn)Am

7、pC酶的G-桿菌越來(lái)越多見(jiàn)，已逐漸引起臨床醫(yī)師的關(guān)注［3］。我科用頭孢西丁藥敏法、表型篩選法、三維試驗(yàn)檢測(cè)97株腸道G-桿菌，加以比較，以找出一種合適臨床常規(guī)應(yīng)用檢測(cè)AmpC酶的方法。 </p><p><b>　　1 材料與方法 </b></p><p><b>　　1.1 菌株 </b></p><p>　　從臨床

8、病人痰、血、尿、分泌物中分離的97株腸道G-桿菌株，質(zhì)控菌株陰溝腸桿菌O29M和1194E從衛(wèi)生部臨檢中心購(gòu)得，分別作為AmpC酶陽(yáng)性和陰性對(duì)照，大腸埃希菌ATCC25922為三維試驗(yàn)指示菌。 </p><p>　　1.2 儀器與試劑 </p><p>　　M-H瓊脂、肉湯由杭州天和微生物試劑公司購(gòu)得，低溫冰凍離心機(jī)為德國(guó)Hettich公司生產(chǎn)， 型號(hào)：Zentrifugen D―785

9、32 Tuttlingen,恒溫箱，藥敏紙片為OXOID公司產(chǎn)品。 </p><p>　　1.3 頭孢西?。‵OX）藥敏法［4］ </p><p>　　按NCCLS標(biāo)準(zhǔn)1999版操作，待測(cè)菌株對(duì)FOX耐藥，視為初篩AmpC酶陽(yáng)性。 </p><p>　　1.4 表型篩選法［3］ </p><p>　　按NCCLS標(biāo)準(zhǔn)1999版操作，用亞胺

10、培南（IPM）、頭孢吡肟（FEP）、頭孢他啶/克拉維酸（CD02）、頭孢噻肟/克拉維酸（CD03）、頭孢噻肟（CTX）5種紙片進(jìn)行篩選。判斷標(biāo)準(zhǔn)：FEP、IPM表現(xiàn)為敏感，而CD02、CD03、CTX表現(xiàn)為耐藥或在CD02、CD03和CTX的抑菌環(huán)內(nèi)存在散在菌落判斷為AmpC酶陽(yáng)性；IPM表現(xiàn)為敏感，而FEP、CTX、CD02、CD03均耐藥，提示待測(cè)菌株產(chǎn)AmpC酶的同時(shí)也產(chǎn)生其他β內(nèi)酰胺酶，如產(chǎn)ESBLs。 </p>

11、<p>　　1.5 三維試驗(yàn)法 </p><p>　　1.5.1 酶粗提物的制備［5］ </p><p>　　待測(cè)菌于肉湯中增菌，接種于M-H平板(直徑為9 cm)中，置于37 ℃恒溫箱內(nèi)孵育24 h。刮取1/4平板的密布菌落于1 mL生理鹽水中混勻。-20 ℃反復(fù)凍溶5次,每次凍的時(shí)間不少于2 h。12 000 r/min，4 ℃離心15 min，取上清液，經(jīng)M-H平板上

12、常規(guī)細(xì)菌培養(yǎng)陰性后于-20 ℃保存。 </p><p>　　1.5.2 三維試驗(yàn)［6］ </p><p>　　將大腸埃希菌ATCC25922制成0.5麥?zhǔn)蠁挝坏木鷳乙海妹薨艟鶆蛲坎加贛-H平板上，稍干后，在平板中央貼30 μg的FOX紙片，在距離紙片5 mm處向外緣方向打一長(zhǎng)10 mm，寬1 mm的矢狀槽，在槽內(nèi)加30 μL粗酶提取物。置于37 ℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)18～24 h。觀察槽

13、內(nèi)側(cè)端(FOX紙片的抑菌環(huán)內(nèi))周圍有無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)，如槽附近的抑菌圈縮小或變形均提示細(xì)菌產(chǎn)AmpC酶，即為三維試驗(yàn)陽(yáng)性，如抑菌圈無(wú)絲毫變化則為三維試驗(yàn)陰性。 </p><p>　　1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 </p><p>　　采用χ2檢驗(yàn)，以P&lt;0.05為差異有顯著性。 </p><p><b>　　2 結(jié) 果 </b></p&

14、gt;<p>　　2.1 97株腸道G-桿菌都經(jīng)頭孢硝噻吩法檢測(cè)為β內(nèi)酰胺酶陽(yáng)性，其中三維試驗(yàn)AmpC酶陽(yáng)性率為155%(15/97)。 </p><p>　　2.2 頭孢西丁藥敏法、表型篩選法與三維試驗(yàn)結(jié)果符合率比較 見(jiàn)表1。97株腸道桿菌頭孢西丁藥敏法結(jié)果顯示產(chǎn)AmpC酶共有36 株，占37.1%（36 /97），與三維試驗(yàn)相比總符合率為74.2%，經(jīng)卡方檢驗(yàn)，差異有顯著性(P&l

15、t;0.05)。表型篩選法產(chǎn)AmpC酶的菌株有15株，占15.5%（15/97），與三維試驗(yàn)相比總符合率為91.8 %，差異無(wú)顯著性（P&gt;0.05）。表1 三種AmpC酶檢測(cè)法結(jié)果比較（略） </p><p><b>　　3 討 論 </b></p><p>　　1989年Bauernfeid 在漢城首次發(fā)現(xiàn)了質(zhì)粒介導(dǎo)的AmpC酶。近年來(lái)世界各地陸續(xù)

16、報(bào)道了各種型別的由染色體和持粒介導(dǎo)的AmpC酶。AmpC酶按其產(chǎn)生的方式分為3類：誘導(dǎo)高產(chǎn)酶、持續(xù)高產(chǎn)酶和持續(xù)低產(chǎn)酶。其中持續(xù)高產(chǎn)酶是指菌株因?yàn)槿プ瓒敉蛔?，引起AmpC酶的大量表達(dá)，質(zhì)粒介導(dǎo)的AmpC酶往往都屬于此類AmpC酶［6］。目前認(rèn)為很多G-桿菌如腸桿菌屬、枸櫞酸桿菌屬、銅綠假單胞菌等絕大多數(shù)均可產(chǎn)生低水平染色體介導(dǎo)的誘導(dǎo)型AmpC酶，因而對(duì)染色體介導(dǎo)的誘導(dǎo)型AmpC酶的檢測(cè)無(wú)多大的臨床意義［7］。質(zhì)粒介導(dǎo)的持續(xù)高產(chǎn)型AmpC酶

17、可見(jiàn)于克雷伯菌、沙門菌、大腸埃希菌等，產(chǎn)生這種AmpC酶的細(xì)菌具有較強(qiáng)的橫向傳播能力［8］，此種質(zhì)粒同時(shí)偏碼對(duì)其他抗生素的耐藥性，表現(xiàn)為對(duì)第一代到第三代頭孢菌素、頭霉素、氨基糖苷類及抗假單孢菌青霉素均耐用藥，但對(duì)碳青霉烯類、第四代頭孢菌素和氟喹諾酮類敏感，故對(duì)此類質(zhì)粒介導(dǎo)的持續(xù)高產(chǎn)型AmpC酶的檢測(cè)，對(duì)于及早發(fā)現(xiàn)并控制耐藥性的傳播具有重要的意義［9］，是臨床微生物實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)的重點(diǎn)。但目前尚未有一種簡(jiǎn)便、可靠的適用于臨床微生物試驗(yàn)室常規(guī)使

18、用的檢測(cè)方法。酶提取物三維試驗(yàn)雖</p><p>　　頭孢西丁藥敏法操作簡(jiǎn)便，但因不產(chǎn)AmpC酶的G-桿菌對(duì)頭孢西丁也有一定的耐藥率［6］，與三維試驗(yàn)法的總符合率僅為74.2 %（72/97），故此法僅可作為初步篩選方法；表型篩選法操作簡(jiǎn)便，快速省時(shí)，結(jié)果基本可靠，跟三維試驗(yàn)法有較高的符合率為 91.8 %（89 /97），與趙虎［6］等報(bào)道的符合率(89.58%)相近，且與三維法比較差異無(wú)顯著性，可以作為臨床常

19、規(guī)快速檢測(cè)的方法加以推廣應(yīng)用。 </p><p><b>　　參考文獻(xiàn): </b></p><p>　?。?］BUSH K,JACOBY G A,Medeiros A A. A functional classification for βlactoamases and it correlation with molecular structure［J］. Antim

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