環(huán)境中多氯聯(lián)苯的免疫檢測方法研究.pdf

1、多氯聯(lián)苯類環(huán)境污染物屬于《斯德哥爾摩公約》中確定的21類持久性有機(jī)污染物。因?yàn)槠渚哂懈叩幕瘜W(xué)穩(wěn)定性和脂溶性，易于在生物體內(nèi)富集，在生物體內(nèi)表現(xiàn)出了一定的類激素功能，對環(huán)境生物及人類健康已經(jīng)形成了不可估量的潛在威脅。對其篩選及檢測方法的研究已經(jīng)成為國際上環(huán)境科學(xué)的研究前沿和熱點(diǎn)課題之一。
　　 加強(qiáng)對多氯聯(lián)苯類污染物的檢測分析是對其進(jìn)行環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)評價(jià)及對它們實(shí)施防控的重要前提。目前，常見的檢測方法有氣相色譜法、高效液相色譜法和氣質(zhì)聯(lián)

2、用等色譜分析技術(shù)。但是這些儀器分析方法存在設(shè)備復(fù)雜、操作要求尤其是樣品前處理要求苛刻、價(jià)格昂貴、測定周期長等缺陷，不適合于現(xiàn)場快速檢測和大批量分析。因此發(fā)展有效的生物分析技術(shù)是此類污染物檢測方法未來的發(fā)展方向。酶聯(lián)免疫分析及熒光定量免疫PCR技術(shù)由于其高特異性和高靈敏性而無需復(fù)雜的前處理過程，是很有發(fā)展前景的檢測分析方法。
　　 在作者的博士論文“熒光定量免疫PCR技術(shù)檢測多氯聯(lián)苯類污染物研究”的基礎(chǔ)上，對該類污染物的酶聯(lián)免疫法

3、和熒光定量免疫PCR技術(shù)進(jìn)行了進(jìn)一步的完善和補(bǔ)充。主要側(cè)重點(diǎn)放在了對多氯聯(lián)苯類污染物的總量測定和分量測定的方法研究上。選用三種有代表性的多氯聯(lián)苯PCB12，PCB37，PCB77作為研究對象，根據(jù)免疫檢測的技術(shù)要求，主要通過半抗原衍生物的設(shè)計(jì)和制備、全抗原和抗體的制備與表征，采用酶聯(lián)免疫和熒光免疫PCR技術(shù)，分別建立了兩種多氯聯(lián)苯的總量免疫檢測新方法，并應(yīng)用于實(shí)際樣品的測定。課題的主要研究內(nèi)容為:
　　 1、免疫原和包被原的制備

4、:用活化酯法分別將三種多氯聯(lián)苯半抗原與牛血清蛋白(BSA)偶聯(lián)，制得PCBs的免疫原;用混合酸酐法將半抗原分別與卵清蛋白(OVA)偶聯(lián)，制得PCBs的包被原。產(chǎn)物經(jīng)紫外光譜、蛋白質(zhì)含量測定等方法給予確證。
　　 2.多克隆抗體的制備:針對檢測PCBs污染物的目的不同，采用免疫原對新西蘭大白兔免疫的程序設(shè)計(jì)了兩套程序:為了對環(huán)境中PCBs的分量進(jìn)行測定，采用單一的PCB12，37，77免疫原分別對6只大白兔免疫，獲得對單一PCBs

5、特異性的抗體;為了對環(huán)境中PCBs的總量進(jìn)行測定，采用三種免疫原以(v∶v=1∶1∶1)的比例制備出復(fù)合免疫原對2只大白兔免疫，目的是獲得一類具有族特異性的抗體。通過免疫新西蘭大白兔，對血清進(jìn)行分離和提純，制備了四種效價(jià)高、特異性好的抗多氯聯(lián)苯類環(huán)境激素的新抗體;
　　 3.生物素化探針DNA的制備和純化:生物素化探針DNA是以pUC19質(zhì)粒為模板，在PCR擴(kuò)增體系中加入兩條生物素化了的引物，擴(kuò)增得到的一段103個(gè)堿基對的生物素

6、化DNA。
　　 4.生物素化抗體的制備:通過活化生物素法，把一種具有族特異性的多抗與活化生物素(BNHS)進(jìn)行偶聯(lián)，產(chǎn)物經(jīng)過透析純化后，得到用來測定PCBs總量的特異性生物素化抗體;
　　 5、利用制備的單一PCBs多克隆抗體和人工包被原，優(yōu)化相關(guān)反應(yīng)條件，如PBS的pH值、DMSO含量，封閉液，酶標(biāo)二抗的稀釋倍數(shù)等后，建立了測定多氯聯(lián)苯分量的PCB77的間接競爭ELISA方法，其線性范圍為0.01-100μg/L，檢

7、出限分別為:IC90為0.056μg/L，并將該法用于測定東海近海岸沉積物中多氯聯(lián)苯的含量，回收實(shí)驗(yàn)顯示回收率在84％-112％之間。實(shí)驗(yàn)結(jié)果與GC/ECD的結(jié)果具有良好的一致性。
　　 6、建立了直接競爭實(shí)時(shí)定量免疫聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(直接競爭rt-IPCR)分析方法，用于環(huán)境PCBs總量的檢測。在優(yōu)化的擴(kuò)增程序下，建立了直接競爭rt-IPCR分析方法標(biāo)準(zhǔn)曲線，對污染物進(jìn)行檢測，得到線性范圍為1×101-1×106pg/L，檢出限

8、為10.25 pg/L，相關(guān)系數(shù)為0.98。應(yīng)用于室內(nèi)空氣樣品中多氯聯(lián)苯的檢測分析，并考察了方法的特異性及樣品回收率，結(jié)果令人滿意。與GC/MS測定結(jié)果比較，發(fā)現(xiàn)兩者相關(guān)性較好，在誤差范圍內(nèi)存在的差異是可以接受的。
　　 通過研究可知，間接競爭ELISA的檢測靈敏度比直接競爭rt-IPCR低近100倍。直接競爭rt-IPCR的工作曲線有較好相關(guān)性。通過對實(shí)驗(yàn)過程各步驟的檢測條件優(yōu)化發(fā)現(xiàn)，當(dāng)采用0.8％的戊二醛溶液處理聚丙烯PCR

9、管后，可以提高對包被原的吸附能力，同時(shí)各種包被介質(zhì)和包被時(shí)間、最佳抗原抗體結(jié)合濃度，包被液和封閉液、以及親和素和生物素化DNA探針的濃度被優(yōu)化，這些優(yōu)化措施提高了檢測的準(zhǔn)確性。方法的特異性、回收率也被加以研究。研究結(jié)果顯示制備出的簇特異性抗體對三種多氯聯(lián)苯單體(PCB12，37，77)和Aroclor(1242，1248)產(chǎn)品具有良好專一性，并具有較好的回收率。本方法應(yīng)用于室內(nèi)環(huán)境空氣樣品的檢測，實(shí)驗(yàn)結(jié)果與GC/MS的測定結(jié)果相比，具有