犬高危穿透性角膜移植術(shù)及術(shù)后免疫排斥的研究.pdf

1、目的:該試驗以本地犬為試驗動物構(gòu)建了角膜高危病理模型,并行穿透性角膜移植手術(shù),探討高危病例的手術(shù)操作以及比較不同藥物控制術(shù)后免疫排斥反應(yīng)的療效。
　　 方法:(1)選擇健康本地犬45只作為試驗犬,使用1mol/L的NaoH溶液對所有試驗犬左眼進(jìn)行堿燒傷建立角膜高危病例模型,術(shù)后每天使用裂隙燈對術(shù)眼進(jìn)行觀察并測量新生血管長度。(2)將45只堿燒傷模型犬作為受體,選擇23只健康本地犬作為供體犬,進(jìn)行穿透性角膜移植手術(shù),并對術(shù)中和術(shù)后

2、的并發(fā)癥進(jìn)行監(jiān)控,術(shù)后每天裂隙燈檢查術(shù)眼情況。分別測定術(shù)眼術(shù)前、燒傷后和術(shù)后第5d的眼壓。(3)選擇3只健康本地犬,取左眼為試驗眼進(jìn)行藥物刺激試驗。使用1％RAPA滴眼液進(jìn)行滴眼一周,每日進(jìn)行裂隙燈檢查,觀察期滿取試驗眼進(jìn)行組織學(xué)檢查。將45只術(shù)犬隨機(jī)分為三組,生理鹽水組,CSA組和RAPA組,每組各15只術(shù)犬,每天行裂隙燈檢查,連續(xù)觀察角膜排斥情況60d。并于術(shù)后第10d、30d、60d各組隨機(jī)抽取3只試驗犬取術(shù)眼角膜進(jìn)行組織病理學(xué)檢

3、查,觀察各組角膜組織結(jié)構(gòu)情況。(4)選擇3只健康未手術(shù)犬為對照,構(gòu)建含有犬VEGF基因的重組質(zhì)粒VEGF-pMD19-T和含有犬β-A ctin基因的重組質(zhì)粒β-A ctin-pMD19-T,將其質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行熒光定量PCR,獲得符合熒光定量PCR條件的標(biāo)準(zhǔn)曲線、融解曲線和擴(kuò)增曲線,用于犬VEGF和β-Actin基因的組織表達(dá)研究。選擇45只術(shù)犬為研究對象,分別于術(shù)后第10d、30d、60d各組隨機(jī)抽取3只試驗犬取術(shù)眼角膜進(jìn)行熒光定量P

4、CR檢測,最后使用△△Ct法分析角膜組織VEGF基因的相對表達(dá)量。
　　 試驗結(jié)果:(1)燒傷后整個角膜出現(xiàn)高度水腫現(xiàn)象。角膜緣毛細(xì)血管擴(kuò)張,從第3d開始新生血管開始從角鞏膜緣向角膜內(nèi)浸潤。隨燒傷時間的推移,新生血管不斷長入角膜內(nèi),并呈明顯上升趨勢,燒傷后第9d,較多粗大的新生血管長入角膜中央,病理模型建立成功。(2)所有45只術(shù)犬在手術(shù)過程中和術(shù)后并發(fā)癥情況為:角膜植片內(nèi)皮輕微缺損3例,發(fā)生率為6.67％,植床質(zhì)量一般5例,發(fā)

5、生率為11.1％,虹膜損傷4例,發(fā)生率為8.89％,前房形成困難3例,發(fā)生率為6.67％,術(shù)后感染2例,發(fā)生率為4.44％,前房積血1例,發(fā)生率為2.22％。燒傷前犬眼壓為15.70±0.18mmHg,燒傷后眼壓為9.48±0.20mmHg,術(shù)后第5d眼壓為15.34±0.20mmHg,術(shù)后第5d與正常犬眼壓比較差異不顯著(P＞0.05)。燒傷后分別與燒傷前和術(shù)后犬眼壓相比較差異均極顯著(P＜0.01)。(3)1％RAPA滴眼液眼部刺激

6、試驗各項得分均為0分,表明1％RAPA滴眼液對眼無刺激性。組織病理切片顯示角膜組織正常。生理鹽水組角膜出現(xiàn)免疫排斥的平均時間為10.83±2.93d,CSA組角膜出現(xiàn)免疫排斥的平均時間為49.33±9.61d,RAPA組角膜出現(xiàn)免疫排斥的平均時間為56.17±6.34d,至觀察期滿,生理鹽水組無角膜植片存活,CSA組仍有2例角膜植片保持透明,除去采樣犬只數(shù),成功率為33.33％,RAPA組仍有5例角膜植片保持透明,成功率為83.33％。

7、各試驗組間兩兩相互比較,具有統(tǒng)計學(xué)差異,CSA組、RAPA組分別與生理鹽水細(xì)比較,角膜發(fā)生免疫排斥時間明顯延后(P＜0.01),差異性極顯著。CSA組與RAPA組比較,角膜發(fā)生免疫排斥的時間差異性不顯著(P＞0.05)。組織病理學(xué)結(jié)果顯示,術(shù)后10d:生理鹽水組角膜組織切面厚度增加,上皮細(xì)胞層排列紊亂,有溶解、丟失現(xiàn)象,基質(zhì)層增厚,膠原纖維排列紊乩,后彈力層無明顯變化,內(nèi)皮細(xì)胞部分?jǐn)嗔?、丟失。CSA組角膜組織厚度與各層結(jié)構(gòu)無明顯變化。R

8、APA組角膜組織結(jié)構(gòu)無明顯改變。術(shù)后30d:生理鹽水組角膜組織切面厚度進(jìn)一步增加,上皮層溶解現(xiàn)象明顯,大量巨噬細(xì)胞浸潤,基質(zhì)層內(nèi)可見毛細(xì)血管腔和炎性細(xì)胞浸潤,后彈力層與相鄰結(jié)構(gòu)連接有所脫落,內(nèi)皮細(xì)胞丟失嚴(yán)重。CSA組角膜組織切面有略微增厚,組織結(jié)構(gòu)保持完整。RAPA組角膜組織切面厚度輕微增厚,組織紿構(gòu)正常。術(shù)后60d:生理鹽水組角膜組織切面層厚度變薄,上皮細(xì)胞層幾乎完全溶解,細(xì)胞壞死,胞核散落分布,基質(zhì)層充滿大量紅細(xì)胞,后彈力層脫落,內(nèi)

9、皮細(xì)胞幾乎完傘丟失。CSA組角膜上皮表層細(xì)胞排列輕度紊亂并有少量丟失,基層內(nèi)有少量紅細(xì)胞聚集,后彈力層結(jié)構(gòu)完整,內(nèi)皮細(xì)胞有所丟失和脫落。RAPA組整個角膜組織切面層厚度變化不明顯,各層絹織結(jié)構(gòu)均無異常,內(nèi)皮細(xì)胞有極少量丟失。(4)術(shù)后10d、30d和60d生理鹽水組角膜組織VEGF基因的表達(dá)量分別為正常角膜組織VEGF表達(dá)量的540.05、978.53、1218.57倍,CSA組為正常角膜組織的240.61、240.10、137.75倍

10、。RAPA組為正常角膜組織的152.96、133.59、35.65倍,差異均極顯著(P＜0.01)。術(shù)后10d、30d和60dCSA組和RAPA組角膜組織VEGF基因的表達(dá)量分別為生理鹽水組的0.45、0.25、0.11倍和0.28、0.14、0.03倍,差異均極顯著(P＜0.01)。各試驗組不同時間點(diǎn)VEGF的表達(dá)量分別為:生理鹽水組術(shù)后30d和60d分別為術(shù)后10d的1.81和2.26倍,差異均極顯著(P＜0.01)。CSA組術(shù)后3

11、0d和60d分別為術(shù)后10d的0.99和0.57倍,差異性分別為不顯著(P＞0.05)和差異性極顯著(P＜0.01)。RAPA組術(shù)后30d和60d分別為術(shù)后10d的0.87和0.23倍,差異性顯著(P＜0.05)和差異性極顯著(P＜0.01)。
　　 結(jié)論:(1)采用1mol/L的。NaoH溶液對角膜進(jìn)行燒傷效果較好,能建立理想的高危角膜病理模型。(2)CSA滴眼液應(yīng)用于犬高危穿透性角膜移植術(shù),能夠較為顯著抑制炎性細(xì)胞浸潤,對抑