犬高危穿透性角膜移植術后排斥反應與TNF-α變化的相關性研究.pdf

1、目的:本試驗以重慶本地小型雜交犬為試驗動物,先構建高危(化學傷)角膜病理模型,而后進行穿透性角膜移植手術,術后觀察排斥反應與外周血和角膜組織中TNF-α變化情況。
　　 方法:(1)選擇健康(無眼疾)本地犬34只作為試驗犬,使用1mol/L的NaOH溶液對所有試驗犬左眼角膜正中進行堿燒傷。術后每天使用裂隙燈顯微鏡對術眼觀察各層情況并測量新生血管長度。(2)選擇17只健康本地犬作為供體犬,對34只堿燒傷模型犬行穿透性角膜移植手術,

2、并嚴格監(jiān)控術中、術后的并發(fā)癥,術后分生理鹽水組和(1%RAPA)治療組分別處置。每天裂隙燈顯微鏡觀察術眼情況并記錄。(3)分別取生理鹽水組和(1%RAPA)治療組8只于建立燒傷模型前,手術當日,術后第7、14、21、28、35、42、49、56d采前肢頭靜脈血,用酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)雙抗體夾心法檢測TNF-α濃度;其余18只犬隨機分成兩組(處置方法同上),分別在術后第7、28、56d各組隨機抽取3只取眼,另外選取3只健康犬作為空自

3、對照組,對所取角膜均分三份,一份用于測定犬角膜組織TNF-α含量,一份用于HE染色觀察角膜組織病理學變化;最后一份進行熒光定量PCR檢測,最后使用△△Ct法分析角膜組織TNF-α基因的相對表達量。
　　 試驗結果:(1)燒傷當日角膜全層即刻呈現(xiàn)出銀白色云霧狀,3d后出現(xiàn)不同程度的水腫,混濁度明顯加劇,5d后角膜緣開始浸潤新生血管并向角膜中心方向生長,7d后炎癥加劇,血管向角膜中心彌散,9d左右某些角膜基質層溶解現(xiàn)象加劇,新生血管

4、變得粗大,模型建立成功。(2)所有PKP術犬均無縫線崩裂現(xiàn)象,但有兩例在術后3天即發(fā)生急性排斥反應需重新補充;生理鹽水組術后術犬術眼周圍均有大量分泌物分泌,3d時植片均出現(xiàn)輕微水腫,6d時角膜植片植床交界處開始出現(xiàn)明顯炎癥反應,7d時有部分血管開始長入角膜植片內,15d時所有術犬均出現(xiàn)捧斥反應,28d時植片開始出現(xiàn)質感變硬的現(xiàn)象,56d時角膜組織開始肉質化:(1%RAPA)治療組眼分泌物較之生理鹽水組少,3d時植片透明無明顯水腫現(xiàn)象,6

5、d時術犬出現(xiàn)新生血管向植片生長的現(xiàn)象。部分犬只角膜出現(xiàn)輕度水腫。7d時新生血管有所增多但仍未到達排斥反應標準。15d時植片的水腫和混濁程度有明顯的改善,新生血管出現(xiàn)消退,28d時植片轉歸透明,56d時除3例排斥外其余角膜植片仍保持透明,未出現(xiàn)排斥反應。(3)堿燒傷后及堿燒傷角膜移植術后早明各組實驗犬外周血中TNF-α含量均升高,生理鹽水組含量于28d后達最高水平(94.10±1.66pg·ml-1)并在以后的監(jiān)測期內維持較高含量,治療組

6、在臨床診斷捧斥反應發(fā)生前術后第14d達最高水平(68.22±0.90pg·ml-1),而后開始下降,到術后56d幾乎接近術前正常水平(37.76±1.07pg·ml-1),生理鹽水組和治療組與空白對照組相比差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01);堿燒傷角膜移植術后各組(空白對照組除外)實驗犬角膜組織中TNF-α含量均升高,在術后28d時治療組出現(xiàn)峰值(31.99±0.84pg·ml-1)而后下降,生理鹽水組含量在術后28d后仍在增長,并在術后

7、56d時達到37.53±0.94pg·ml-1且仍有繼續(xù)增長的趨勢;病理組織學結果顯示,術后7d:生理鹽水組角膜組織各層細胞出現(xiàn)嚴重水腫,上皮細胞層有溶解、丟失現(xiàn)象,基質層增厚,內有一定量新生血管生長及紅細胞侵潤。內皮細胞部分斷裂、丟失。治療組角膜各細胞層有輕微水腫現(xiàn)象,上皮層有所增厚,有少量紅細胞侵潤.后彈力層和內皮層結構完整。術后28d,生理鹽水組角膜組織各層細胞水腫加劇,上皮細胞層開始出現(xiàn)斷裂脫離現(xiàn)象,基質層內有大量新生血管生長及

8、紅細胞侵潤,膠原纖維原有捧列被完全打亂,后彈力層與內皮細胞層開始大量脫離和丟失。治療組術犬角膜各細胞層規(guī)則捧列,水腫現(xiàn)象明顯消退,上皮層完整無丟失,基質層纖維排列較為緊湊均勻,新生血管生長和紅細胞侵潤現(xiàn)象有所改善,后彈力層和內皮層結構仍保持完整。術后56d:生理鹽水組上皮細胞層幾乎完全溶解,僅存的細胞也己壞死,紅細胞以完全侵潤整個基質層,幾乎沒有內皮細胞存留。治療組各細胞層組織學結構完全一致,無明顯水腫增厚現(xiàn)象?；|層纖維均勻排列,內皮

9、層細胞僅少量缺失。(4)術后角膜中TNF-α基因的含量均有表達且無論是組內或組間在不同時間段角膜TNF-α基因的表達量均呈現(xiàn)出一定的差異性,角膜TNF-α基因在不同時間段表達量與組織中含量的變化一致。
　　 結論:(1)雷帕霉素滴眼液滴眼液對犬高危穿透性角膜移植手術能起到抗免疫排斥反應作用,能夠明顯抑制新生血管生長,發(fā)揮強大的免疫抑制作用。(2)TNF-α濃度變化與裂隙燈顯微鏡觀察和病理組織切片結果一致,外周血1NF-α含量變化